GATK: the Genome Analysis Toolkit Il Genome Analysis Toolkit o, più semplicemente GATK, è un software ampiamente utilizzato per analizzare i dati di sequenziamento ad alta resa. GATK è stato sviluppato dal gruppo di lavoro Data Science and Data Engineering del Broad Institute. Questo toolkit specializzato fornisce agli utilizzatori un’ampia selezione di tools focalizzati sulla scoperta di
Una molecola vulnerabile L’estrazione dell’RNA dai campioni biologici è complicata dalla vulnerabilità della molecola di RNA stessa e dalla presenza ubiquitaria di enzimi ribonucleasici nelle cellule, nei tessuti e nell’ambiente che possono rapidamente degradare l’RNA (come ad esempio, RNase 7, un componente della superfamiglia dell’RNase A, che viene secreto dalla pelle umana come potente difesa
Panoramica Il sequenziamento del DNA dell’intero genoma di una singola cellula (Singe cell genome sequencing) è stato descritto da numerosi autori. Il sequenziamento dell’intero genoma di una singola cellula è di interesse in numerose applicazioni di nicchia, come la misurazione della diversità genomica dei gameti di un individuo, la determinazione della fase delle mutazioni e
INTERO&TARGETED La diagnostica molecolare può essere ad oggi suddivisa in strategia “intera” (sequenziamento dell’intero esoma o dell’intero genoma) o strategia “targeted” (sequenziamento di un singolo gene o di un pannello). I metodi per l’identificazione delle CNV variano notevolmente a secondo dell’approccio desiderato. Qui sotto vi guidiamo alla scelta giusta (con le tecniche che abbiamo scelto).
NGS, coverage e identificazione delle CNV Il sequenziamento di nuova generazione (NGS, Next Generation Sequencing) ha cambiato profondamente il mondo dei test genetici, permettendoci di sequenziare l’intero esoma o l’intero genoma in un singolo esperimento, e con un livello di efficienza, convenienza e scalabilità senza precedenti. Il sequenziamento ad alta resa basato sulla produzione di
Cosa è il “coverage”? Sebbene il significato del termine coverage possa sembrare molto semplice, spesso questo termine viene utilizzato impropriamente. Nell’ambito della Next-Generation Sequencing, il coverage indica il numero medio di reads che “coprono” una determinata regione target di riferimento. Il coverage descrive quindi sempre una relazione tra il numero di reads e una regione
Qual è il prezzo giusto per il sequenziamento dell’intero esoma? Questa è una delle domande più frequenti che mi vengono poste e una delle più cercate su Internet: qual è il prezzo per il sequenziamento dell’intero esoma (che consiste nel sequenziamento di tutti i geni umani)? Da notare, il sequenziamento dell’intero esoma non consiste nel
Cosa sono le duplicazioni segmentali? Le duplicazioni segmentali (note anche come ripetizioni a basso numero di copie) sono frammenti di DNA più lunghi di 1 Kbp (ovvero 1.000 coppie di basi), distribuiti all’interno e tra i cromosomi, che hanno sequenze genomiche identiche per più del 90%. Si pensa che abbiano un ruolo significativo nell’evoluzione e
Test genetici: un lavoro complesso. I pazienti e i medici a volte si lamentano del turnaround time (tempo di consegna, TAT) dei test genetici. Ora, va detto che i test genetici sono tecnicamente complessi e richiedono numerosi passaggi di manipolazione del campione. Soprattutto per quanto riguarda i test genetici per le malattie rare, c’è anche
Cosa sono i file bed? Se sei interessato, o direttamente coinvolto, in applicazioni Next Generation Sequencing per ricerca o diagnostica, in particolare per il sequenziamento dell’intero esoma o di pannelli multigene, avrai sicuramente sentito parlare dei cosiddetti bed files. Se non ne hai ancora sentito parlare, presto sentirai la necessità di sapere cosa sono e
Qui sotto la tabella con i codici (simboli) degli amminoacidi (a 1 o tre lettere). La nomenclatura approvata per la descrizione dei risultati di un indagine genetica è quella a tre lettere. Amminoacido Codice a una lettera Codice a tre lettere (ufficiale) Alanina A Ala Arginina R Arg Asparagina N Asn Acido aspartico D Asp
Il primo sequenziatore NGS Parlare del sistema del sistema Roche 454 significa partire dagli albori della Next Generation Sequencing. Le prime tre piattaforme di Next Generation Sequencing (NGS) erano prodotte da tre compagnie indipendenti che, poco più tardi, furono acquisite da altri gruppi industriali. Il sistema 454 è basato sul pyrosequencing, una tecnica basata sull’incorporazione di pirofostati durante la
MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, HiSeq X, Novaseq La tecnologia Next Generation Sequencing di Illumina è basata su un sistema originariamente ideato e messo a punto da Solexia, azienda acquisita da Illumina nel 2007. Le piattaforme Illumina sono basate sulla tecnologia SBS chemistry (reversible-terminator sequencing by synthesis). Il primo sequenziatore prodotto da Solexia si chiamava Genome Analyzer,
Due modi di fare NGS Come già visto in Cosa è una read?, una read è una corta sequenza di DNA di sintesi che viene prodotta durante la reazione di sequenziamento. Il sequenziamento NGS può essere fatto utilizzando single-end reads o paired-end reads. Sequenziare in una o due direzioni? I frammenti che si utilizzano nella costruzione della
Passo NGS fondamentale La preparazione della cosiddetta sequencing library (libreria di sequenziamento) è un passo fondamentale per tutte le reazioni di Next Generation Sequencing. Esistono diversi modi di preparare una sequencing library, a seconda del tipo di piattaforma che si desidera utilizzare (Life Technologies, Illumina, Roche, Pacific Biosciences sono fra le piattaforme NGS più diffuse). Librerie
Un concetto solo apparentemente difficile Una read è una piccola sequenza di DNA di sintesi che si ottiene da una reazione di sequenziamento. Il sequenziamento può essere fatto essenzialmente seguendo uno dei seguenti due principi: (1) chromosome walking: la reazione procede in modo ordinato lungo il cromosoma, (2) shotgun sequencing: vengono amplificati e sequenziati pezzi a
Tutto inizia nel 1977 La possibilità di sequenziare parti del genoma umano (e di altri esseri viventi) si è avuta a partire dalle intuizioni di Frederick Sanger, il quale riuscì a mettere a punto un sistema di sequenziamento già nel lontano 1977. Il metodo Sanger è noto anche come metodo a terminatori di catena. Il
Una rivoluzione in termini di resa, costi e tempi La Next Generation Sequencing (NGS) ha rivoluzionato l’approccio allo studio del genoma. Per molti anni il sequenziamento è stato fatto tramite elettroforesi capillare (tipicamente sequenziamento Sanger), che consente di ricostituire la sequenza di un singolo frammento di DNA. Il sequenziamento Sanger avviene tramite la registrazione dei
Accanto a DGV, DGVa e DECIPHER, c’è un altro database che elenca le variazioni strutturali del DNA. Si tratta di dbVar, che ci si aspetta essere il più completo dato il suo illustre marchio di fabbrica: NCBI. Cosa sono le variazioni strutturali Prima di proseguire ricordiamo la definizione di variazione o variante strutturale, che è
Pochi semplici passi per spiegare la NGS Dopo anni in cui il Sanger sequencing ha rappresentato il gold standard della diagnostica genetica molecolare mondiale, le tecniche di nuova generazione (Next Generation Sequencing – NGS, detta anche second generation sequencing) hanno preso il sopravvento. La NGS è anche chiamata high-throughput sequencing (sequenziamento ad alta resa) perchè, a
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