Duplicazioni segmentali

Fortunatamente, la stragrande maggioranza dei geni è priva di duplicazioni segmentali, quindi tecniche come il sequenziamento dell’intero esoma e il sequenziamento dell’intero genoma garantiscono la corretta lettura della maggior parte del genoma umano. Tuttavia, il numero di geni con duplicazioni segmentali non è trascurabile e le duplicazioni segmentali rappresentano ancora un problema importante nel garantire una diagnosi genetica di qualità. Alcuni geni contengono duplicazioni segmentali solo in uno o pochi esoni, mentre altri geni si trovano per tutta la loro lunghezza in una duplicazione segmentale (vedi, ad esempio, i geni dell’alfa talassemia HBA1 e HBA2 o il gene della  sindrome di Ehlers-Danlos-like di tipo 1, TNXB). L’interpretazione dei segnali di sequenziamento provenienti da geni che giacciono in duplicazioni segmentali può essere molto difficile. Tipicamente, le duplicazioni segmentali possono dare un rischio di circa il 15% di una chiamata errata delle varianti. In aggiunta, il rischio di chiamate errate esiste non solo per il sequenziamento di nuova generazione, ma anche per altre applicazioni molecolari. Ad esempio, le duplicazioni segmentali possono influenzare la sensibilità dell’identificazione di mutazione in un MLPA, poiché la sua efficacia si basa sull’omologia tra la sequenza della sonda e la sequenza genica mirata. La stessa cosa accade anche nel sequenziamento Sanger, se i primer per la PCR sono disegnati per legarsi all’interno della regione duplicata.

Ad oggi, la risposta a questa domanda è semplice: i metodi NGS utilizzati per la diagnostica si basano su reads brevi (es. il sequenziamento Illumina produce reads di 150 pb) (per conoscere il significato di reads, vedere qui). Come detto sopra, le duplicazioni segmentali sono solitamente più grandi di 1.000 pb, quindi reads di 150 pb possono essere mappate in modo errato in una qualsiasi delle sequenze note che mostrano il 90% di omologia. Al contrario, reads più lunghe, con estremità che si legano a sequenze di DNA specifiche che circondano la duplicazione segmentale, consentirebbero la mappatura della sequenza nella corretta posizione cromosomica. Il sequenziamento basato su reads lunghe esiste già da diversi anni, ma il problema è la sua adattabilità alla diagnostica, perché il sequenziamento basato su reads lunghe ha ancora un alto tasso di errore nel rilevamento di variazioni di singolo nucleotide, pur essendo sempre più preciso nell’identificazione di grandi alterazioni strutturali.