Cosa sono le duplicazioni segmentali?
Le duplicazioni segmentali (note anche come ripetizioni a basso numero di copie) sono frammenti di DNA più lunghi di 1 Kbp (ovvero 1.000 coppie di basi), distribuiti all’interno e tra i cromosomi, che hanno sequenze genomiche identiche per più del 90%. Si pensa che abbiano un ruolo significativo nell’evoluzione e nell’adattamento delle specie, sebbene il loro significato funzionale rimanga in gran parte sconosciuto, anche a causa della loro difficoltà di sequenziamento, che è l’argomento principale di cui parleremo in questo articolo.
Duplicazioni segmentali nel sequenziamento dell’intero esoma e dell’intero genoma
Fortunatamente, la stragrande maggioranza dei geni è priva di duplicazioni segmentali, quindi tecniche come il sequenziamento dell’intero esoma e il sequenziamento dell’intero genoma garantiscono la corretta lettura della maggior parte del genoma umano. Tuttavia, il numero di geni con duplicazioni segmentali non è trascurabile e le duplicazioni segmentali rappresentano ancora un problema importante nel garantire una diagnosi genetica di qualità. Alcuni geni contengono duplicazioni segmentali solo in uno o pochi esoni, mentre altri geni si trovano per tutta la loro lunghezza in una duplicazione segmentale (vedi, ad esempio, i geni dell’alfa talassemia HBA1 e HBA2 o il gene della sindrome di Ehlers-Danlos-like di tipo 1, TNXB). L’interpretazione dei segnali di sequenziamento provenienti da geni che giacciono in duplicazioni segmentali può essere molto difficile. Tipicamente, le duplicazioni segmentali possono dare un rischio di circa il 15% di una chiamata errata delle varianti. In aggiunta, il rischio di chiamate errate esiste non solo per il sequenziamento di nuova generazione, ma anche per altre applicazioni molecolari. Ad esempio, le duplicazioni segmentali possono influenzare la sensibilità dell’identificazione di mutazione in un MLPA, poiché la sua efficacia si basa sull’omologia tra la sequenza della sonda e la sequenza genica mirata. La stessa cosa accade anche nel sequenziamento Sanger, se i primer per la PCR sono disegnati per legarsi all’interno della regione duplicata.
Perché è così difficile leggere le sequenze di DNA che si trovano in duplicazioni segmentali?
Ad oggi, la risposta a questa domanda è semplice: i metodi NGS utilizzati per la diagnostica si basano su reads brevi (es. il sequenziamento Illumina produce reads di 150 pb) (per conoscere il significato di reads, vedere qui). Come detto sopra, le duplicazioni segmentali sono solitamente più grandi di 1.000 pb, quindi reads di 150 pb possono essere mappate in modo errato in una qualsiasi delle sequenze note che mostrano il 90% di omologia. Al contrario, reads più lunghe, con estremità che si legano a sequenze di DNA specifiche che circondano la duplicazione segmentale, consentirebbero la mappatura della sequenza nella corretta posizione cromosomica. Il sequenziamento basato su reads lunghe esiste già da diversi anni, ma il problema è la sua adattabilità alla diagnostica, perché il sequenziamento basato su reads lunghe ha ancora un alto tasso di errore nel rilevamento di variazioni di singolo nucleotide, pur essendo sempre più preciso nell’identificazione di grandi alterazioni strutturali.
Come posso superare il problema delle duplicazioni segmentali?
Identificare una variante genetica in una porzione di un gene che si trova in duuplicazione segmentale pone diversi problemi. Dobbiamo chiederci: la variante ricade in questo gene o si trova realmente in un’altra parte del genoma? Rispondere correttamente a questa domanda farà la differenza tra una diagnosi genetica confermata e un referto negativo (o, peggio ancora, un referto con una diagnosi sbagliata!).
Quindi, dobbiamo prestare attenzione. Di regola, una variante presumibilmente significativa dal punto di vista clinico identificata in una duplicazione segmentale dovrebbe essere confermata da un metodo ortogonale (ad es. sequenziamento Sanger, con o senza PCR preliminare a lungo raggio per isolare il frammento di DNA in cui si ritiene cada la variante). Tuttavia, anche prima di procedere alla conferma molecolare con un’altra tecnica, ci sono alcuni indicatori che il genetista esperto può prendere in considerazione nelle proprie valutazioni. Per esempio:
- Quanto sono rilevanti le informazioni cliniche del paziente per il gene in questione?
Se la variante identificata ricade in un gene associato a una patologia che ben corrisponde alle caratteristiche cliniche del paziente, c’è la possibilità (ma non la certezza) che la variante si trovi in quel gene e non in un’altra parte del genoma.
- Quanto sono buoni i parametri di qualità della variante?
Quanto sono buoni i parametri di sequenziamento delle varianti? I parametri di sequenziamento delle varianti, dalla qualità del genotipo alla profondità di copertura, sono fondamentali nel filtraggio delle varianti e sono disponibili anche nelle duplicazioni segmentali. Valutare correttamente questi parametri e pesarli in relazione alla complessità del caso clinico è molto importante. Alcuni parametri di una variante possono anche essere valutati “visivamente” (o rivalutati) osservando gli allineamenti di sequenziamento. Gli allineamenti sono sicuramente cruciali per valutare la reale localizzazione di varianti che si trovano in duplicazioni segmentali.
Bibliografia
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