Sequencing library: cosa è?

Passo NGS fondamentale

La preparazione della cosiddetta sequencing library (libreria di sequenziamento) è un passo fondamentale per tutte le reazioni di Next Generation Sequencing. Esistono diversi modi di preparare una sequencing library, a seconda del tipo di piattaforma che si desidera utilizzare (Life Technologies, Illumina, Roche, Pacific Biosciences sono fra le piattaforme NGS più diffuse).

Librerie di DNA o RNA

Le librerie possono essere di DNA o di RNA, a seconda che si desideri svolgere analisi di genomica o trascrittomica. I tre step fondamentali nella preparazione di una sequencing library di DNA sono:

1. Frammentazione e dimensionamento del campione ad una lunghezza predefinita
2. Aggancio degli adattatori (adapters) alle estremità dei frammenti ottenuti
3. Quantificazione della libreria ottenuta

Nella preparazione delle sequencing library a partire da RNA è presente uno step ulteriore, che è quello della conversione dell’RNA in una molecola di cDNA. In questo caso, la frammentazione può avvenire prima o dopo la sintesi del cDNA.

Frammentazione dell’acido nucleico

La frammentazione dell’acido nucleico può essere fatta con metodi fisici (frammentazione acustica e sonicazione), enzimatici (tramite l’uso di endonucleasi aspecifiche come la DNase I o la Fragmentase o kit enzimatici commerciali come il Nextera tagmentation kit di Illumina, il quale, fra l’altro, non solo frammenta il DNA, ma procede anche all’aggancio immediato degli adattatori tramite una trasposasi) o chimici. Per la frammentazione del DNA si utilizza solitamente il metodo fisico o enzimatico (Covaris è, ad esempio, uno degli strumenti più diffusi per la sonicazione).

Dimensione dei frammenti

La dimensione dei frammenti da ottenere è un parametro chiave. Essa dipende sia dalla piattaforma che si intende utilizzare sia dallo scopo dell’analisi. Ad esempio, nel sistema Illumina si possono ottenere buoni risultati con frammenti fino a 1500 paia di basi (1500 bp) di lunghezza. Tuttavia, nel caso in cui si desideri procedere al sequenziamento di un esoma, è raccomandabile creare delle sequencing library con inserti (così si chiama tecnicamente il frammento di DNA una volta che gli adattatori sono stati agganciati alle sue estremità) non più lunghi di 200-250 bp. Questo semplicemente perché la dimensione media di un esone umano è di 200 bp.

Aggancio degli adattatori (adapters)

Subito dopo la fase di frammentazione si passa alla fase di aggiunta degli adattatori, seguita da un ulteriore step di dimensionamento (sizing) nel quale si rimuovono tutti i frammenti di lunghezza non desiderata e tutti i dimeri di adattatori (cioè i dimeri che gli adattatori in eccesso hanno formato legandosi fra di loro). È bene ricodare che i dimeri di adattatori possono ridurre sensibilmente la resa della reazione di sequenziamento e che sono particolarmente abbondanti laddove la quantità di DNA iniziale sia particolarmente bassa.

Quantificazione della sequencing library

La quantificazione della sequencing library è uno step fondamentale e dovrebbe avvenire nel modo più preciso e accurato possibile. Le librerie di sequenziamento vengono solitamente quantificate con metodi PCR (digital PCR – dPCR o quantitative PCR – qPCR).

Breda Genetics srl

Breda Genetics srl si affida a partner biotecnologici di primo livello per l’esecuzione dei propri carichi di sequenziamento. Durante la preparazione della sequencing library, a seconda del tipo di esoma, viene fatto uso di metodi di frammentazione fisici (sonicazione, EXOME 50MB) o enzimatici (EXOME 38MB). Poiché per il sequenziamento dell’esoma è importante utilizzare inserti che siano vicini alla dimensione media di un esone umano, gli inserti da noi utilizzati sono solitamente intorno ai 240 bp.