Panoramica
Il sequenziamento del DNA dell’intero genoma di una singola cellula (Singe cell genome sequencing) è stato descritto da numerosi autori. Il sequenziamento dell’intero genoma di una singola cellula è di interesse in numerose applicazioni di nicchia, come la misurazione della diversità genomica dei gameti di un individuo, la determinazione della fase delle mutazioni e l’analisi delle mutazioni somatiche nei tumori o in seguito all’esposizione ad agenti mutageni.
Preparazione della libreria di sequenziamento
La preparazione della libreria di sequenziamento per il sequenziamento del DNA a singola cellula è particolarmente importante, perchè la piccola quantità di acidi nucleici disponibile richiede uno step di amplificazione randomizzata (per leggere un’introduzione generale alle librerie di sequenziamento clicca qui). La questione chiave è che il DNA iniziale deve essere aumentato per raggiungere la quantità minima richiesta per la preparazione della libreria, prima di procedere con la next-generation sequencing.
La strategia più comunemente utilizzata per amplificare il genoma di una singola cellula si basa sulla multiple displacement amplification (MDA), sulla PCR o su metodi combinati (MDA-PCR). MDA utilizza dei primer random con phi29, una polimerasi ad alta produttività. Sebbene questa tecnica sia in grado di generare materiale amplificato a sufficienza per la costruzione della libreria di sequenziamento, soffre di numerosi bias, creati dall’amplificazione non lineare. Un miglioramento nell’utilizzo del metodo MDA può essere fatto aggiungendo uno step di preamplificazione quasi-lineare che riduce i bias (MDA-PCR combinata: MDA preamplificazione e amplificazione con PCR).
Sistema microfluidico
La piccola quantità di DNA utilizzata nel sequenziamento del genoma a singola cellula può essere maneggiata con l’utilizzo di un sistema microfluidico. La microfluidica è emersa agli inizi degli anni ’80 ed è utilizzata per lo sviluppo delle testine di stampa a getto d’inchiostro, tecnologie lab-on-a-chip, micropopulsione, tecnologie microtermiche e studi sul DNA. I flussi di lavoro microfluidici automatici basati su una piccola compartimentazione sono stati progettati per consentire in modo efficiente l’acquisizione e la lisi delle cellule fino a 96 singole cellule per ciclo – Fluidigm (South San Francisco, CA).
Breda Genetics srl
Su richiesta, la Breda Genetics è in grado di offrire il sequenziamento dell’intero genoma del DNA di una singola cellula, dopo amplificazione MDA-PCR quasilineare. Per info e richiesta, contattare info@bredagenetics.com.
References: PMID: 24502796, 22086961, 21170043, 22817899, 27448971, 27510097, 26302375, Wikipedia: Microfluidics.
