Il primo sequenziatore NGS
Parlare del sistema del sistema Roche 454 significa partire dagli albori della Next Generation Sequencing. Le prime tre piattaforme di Next Generation Sequencing (NGS) erano prodotte da tre compagnie indipendenti che, poco più tardi, furono acquisite da altri gruppi industriali. Il sistema 454 è basato sul pyrosequencing, una tecnica basata sull’incorporazione di pirofostati durante la reazione di accrescimento della catena.
La tecnologia del Pyrosequencing
Il sistema 454 fu il primo sequenziatore NGS lanciato sul mercato. Era prodotto dalla 454 (il sequenziatore aveva in effetti lo stesso nome dell’azienda produttrice), che fu poi acquisita da Roche. Il sistema Roche 454 è basato sulla tecnologia del pyrosequencing (così chiamato per via dei pirofosfati che vengono sfruttati nella reazione di sequenziamento). Il Roche 454 riconosce la sequenza grazie al susseguirsi di segnali luminosi causati dal distacco di un pirofosfato ogniqualvolta un nucleotide viene incorporato nel filamento in crescita. I frammenti che compongono la libreria di DNA (DNA library o sequencing library) vengono denaturati ad ottenere filamenti singoli che vengono catturati dagli amplification beads, piccole sfere sulla cui superficie sono ancorati oligonucleotidi che riconoscono e legano gli adattatori (adaptors), che erano stati opportunamente aggiunti alle estremità di ogni frammento (non si dimentichi che, per definizione, la DNA library – o sequencing library – è l’insieme dei frammenti di DNA preparati tramite l’aggiunta degli adattatori).
Emulsion PCR e interrogazione di singolo nucleotide
Quello che segue è un processo cosiddetto di PCR in emulsione (emulsion PCR). Gli amplificati ottenuti vengono posti sulla picotiter plate, un supporto sul quale avviene la reazione di sequenziamento vera e propria. Gli amplificati vengono qui cimentati con una soluzione contenente un solo dNTP per volta (insieme ad altri reagenti che hanno lo scopo di catalizzare l’eventuale reazione luminosa). Se il dNTP somministrato (dATP, dGTP, dCTP o dTTP) è complementare alla prima base da copiare, esso viene incorporato nel filamento in crescita scatenando una reazione luminosa causata dal rilascio del pirofostato. Il dNTP in eccesso viene poi degradato dall’enzima apirasi e lavato via. Gli amplificati vengono quindi cimentati con il dNTP successivo e così via. Come detto sopra, le reazioni luminose vengono registrate ed elaborate dalla macchina, il cui software ricostruisce la sequenza. Questo sistema, nel quale i dNTP vengono aggiunti uno alla volta ad ogni ciclo successivo, si dice sistema a interrogazione di singolo nucleotide.
Aggiornamenti
Il sistema 454 è stato perfezionato da Roche nel corso degli anni. Nel 2008 fu lanciato il 454 GS FLX Titanium, che consentiva di produrre reads di ben 700 bp con un’accuratezza del 99.9% (dopo l’uso di filtri) e un output di 0,7 Gb al giorno. Il successivo perfezionamento tramite il sistema GS Junior portò ad un output di 14 Gb a corsa. I vantaggi maggiori del sistema Roche risiedono nella velocità e nella lunghezza delle reads ottenibili. Il sistema Roche pare tuttavia costoso, specialmente a confronto delle tecnologie successivamente sviluppate dai concorrenti (secondo quanto riportato da Liu L. 2012 – PIMD: 22829749 – il prezzo di un sistema 454 GS FLX si aggirava attorno ai 500.000 $, con un costo a corsa di circa 7.000 $). Un altro punto debole sembra essere il tasso relativamente elevato di errori nella sintesi di tratti di nucleotidi ripetuti (poly-bases) superiori a 6 bp. Va comunque detto che gli stretch di ripetizioni di nucleotidi possono rivelarsi particolarmente difficili da caratterizzare persino nel Sanger sequencing.
Non è ancora chiaro se e per quanto la produzione delle piattaforme 454 continueranno a essere prodotte. Dal sito 454.com si apprende di due sistemi: il sistema GS Junior+ e il sistema GS FLX+.
Il sistema GS Junior +, grazie a nuovi kit, a un nuovo software e a nuovi protocolli, è in grado di produrre reads di 700-800 bp o più. È ideato per il sequenziamento di regioni target di 10-100 campioni e il sequenziamento di genomi di microorganismi e studi di metagenomica. Il sistema GS FLX + riesce a ottenere reads fino a 1000 bp ed è stato pensato per il sequenziamento dell’esoma e dei genomi di organismi complessi.
Breda Genetics srl
Breda Genetics non ha al momento in portafoglio alcuna analisi svolta su macchine 454. Tramite il nostro network di laboratori certificati possiamo tuttavia attivarci per procurare, su richiesta specifica, il sequenziamento anche su questo tipo di piattaforma.
Fonti: la presente review è stata redatta in modo indipendente da Breda Genetics, non si garantisce pertanto la correttezza delle informazioni riportate. Per informazioni ufficiali si prega di consultare il sito www.454.com.
