The first NGS platform
Talking about the system of the Roche 454 means starting from the dawn of Next Generation Sequencing. The first three Next Generation Sequencing (NGS) platforms were produced by three independent companies which, a little later, were acquired by other industrial groups. System 454 is based on pyrosequencing, a technique based on the incorporation of pyrophosphates during the reaction of chain elongation.
Pyrosequencing technology
The 454 system was the first NGS platform launched on the market. It was produced by 454 (the platform had actually the same name as the manufacturer), which was later acquired by Roche. The Roche 454 system is based on pyrosequencing technology (so-called because of pyrophosphates which are used in the sequencing reaction). The Roche 454 recognizes sequence thanks to subsequent bright signals caused by the detachment of a pyrophosphate whenever a nucleotide is incorporated in the growing chain. Fragments that compose DNA library (or sequencing library) are denatured to obtain single strands which are then captured by amplification beads, small spheres on whose surface small oligonucleotides that bind and recognize adaptors are anchored. Adaptors had previously been appropriately added to the ends of each fragment (do not forget that, by definition, the DNA library – or sequencing library – is the set of DNA fragments prepared by adding adaptors).
Emulsion PCR and single nucleotide test
The following is the so-called emulsion PCR. The amplified products are put on a picotiter plate, a support where the real sequencing reaction takes place. The amplified products are tested with a solution containing a only one dNTP at time (in association with other reagents which catalyze the light reaction). In the given dNTP (dATP, dGTP, dCTP o dTTP) is complementary to the first base to be copied, it is incorporated into the growing chain triggering a light reaction caused by the release of pyrophosphate.Quello che segue è un processo cosiddetto di PCR in emulsione (emulsion PCR). Gli amplificati ottenuti vengono posti sulla picotiter plate, un supporto sul quale avviene la reazione di sequenziamento vera e propria. Gli amplificati vengono qui cimentati con una soluzione contenente un solo dNTP per volta (insieme ad altri reagenti che hanno lo scopo di catalizzare l’eventuale reazione luminosa). Se il dNTP somministrato è complementare alla prima base da copiare, esso viene incorporato nel filamento in crescita scatenando una reazione luminosa causata dal rilascio del pirofostato. Il dNTP in eccesso viene poi degradato dall’enzima apirasi e lavato via. Gli amplificati vengono quindi cimentati con il dNTP successivo e così via. Come detto sopra, le reazioni luminose vengono registrate ed elaborate dalla macchina, il cui software ricostruisce la sequenza. Questo sistema, nel quale i dNTP vengono aggiunti uno alla volta ad ogni ciclo successivo, si dice sistema a interrogazione di singolo nucleotide.
Aggiornamenti
Il sistema 454 è stato perfezionato da Roche nel corso degli anni. Nel 2008 fu lanciato il 454 GS FLX Titanium, che consentiva di produrre reads di ben 700 bp con un’accuratezza del 99.9% (dopo l’uso di filtri) e un output di 0,7 Gb al giorno. Il successivo perfezionamento tramite il sistema GS Junior portò ad un output di 14 Gb a corsa. I vantaggi maggiori del sistema Roche risiedono nella velocità e nella lunghezza delle reads ottenibili. Il sistema Roche pare tuttavia costoso, specialmente a confronto delle tecnologie successivamente sviluppate dai concorrenti (secondo quanto riportato da Liu L. 2012 – PIMD: 22829749 – il prezzo di un sistema 454 GS FLX si aggirava attorno ai 500.000 $, con un costo a corsa di circa 7.000 $). Un altro punto debole sembra essere il tasso relativamente elevato di errori nella sintesi di tratti di nucleotidi ripetuti (poly-bases) superiori a 6 bp. Va comunque detto che gli stretch di ripetizioni di nucleotidi possono rivelarsi particolarmente difficili da caratterizzare persino nel Sanger sequencing.
Non è ancora chiaro se e per quanto la produzione delle piattaforme 454 continueranno a essere prodotte. Dal sito 454.com si apprende di due sistemi: il sistema GS Junior+ e il sistema GS FLX+.
Il sistema GS Junior +, grazie a nuovi kit, a un nuovo software e a nuovi protocolli, è in grado di produrre reads di 700-800 bp o più. È ideato per il sequenziamento di regioni target di 10-100 campioni e il sequenziamento di genomi di microorganismi e studi di metagenomica. Il sistema GS FLX + riesce a ottenere reads fino a 1000 bp ed è stato pensato per il sequenziamento dell’esoma e dei genomi di organismi complessi.
Breda Genetics srl
Breda Genetics non ha al momento in portafoglio alcuna analisi svolta su macchine 454. Tramite il nostro network di laboratori certificati possiamo tuttavia attivarci per procurare, su richiesta specifica, il sequenziamento anche su questo tipo di piattaforma.
Fonti: la presente review è stata redatta in modo indipendente da Breda Genetics, non si garantisce pertanto la correttezza delle informazioni riportate. Per informazioni ufficiali si prega di consultare il sito www.454.com.
