Low-pass genome sequencing: una nuova prospettiva per l’analisi delle CNV!

OK, facciamo un passo indietro. Cosa sono le CNV? Le Copy Number Variation (CNV) sono varianti strutturali che consistono in una perdita o in un acquisto di grandi porzioni di genoma. La maggior parte di queste contribuisce alla diversità genomica umana, mentre altre possono causare malattie genetiche. Sebbene il sequenziamento dell’intero esoma e dell’intero genoma siano utilizzati principalmente per identificate piccole variazioni di un singolo nucleotide (SNV), oggi possono essere utilizzati anche per rilevare le CNV.

L’analisi dei microarray cromosomici (o CMA, chromosomal microarray analysis, comprendente array-CGH e high-density SNP-array) è stata a lungo considerata il gold standard per l’analisi delle CNV. La CMA è il test genetico raccomandato come primo approccio il ritardo mentale e le anomalie congenite. La CMA è una tecnologia basata su un microchip, quindi è molecolare (il DNA del paziente viene materialmente utilizzato per eseguire un’analisi “umida” su un array).

L’analisi algoritmica delle CNV consiste nell’identificazione di grandi delezioni/duplicazioni sulla base di calcoli (quindi non è molecolare, è un metodo matematico, basato sui valori medi di un pool di riferimento di controlli e sulla validità dell’algoritmo applicato).

Il low-pass genome sequencing (LPGS, o low-pass GS, o sequenziamento del genoma a basso coverage) consiste nel sequenziamento ad alta resa dell’intero genoma umano ad un basso coverage.

Una pietra miliare è l’articolo pubblicato nel 2015 dal Consorzio The 1000 Genomes Project. Gli autori riportano il completamento del progetto 1000 Genomi, conclusosi con la ricostruzione della sequenza genomica di 2504 individui provenienti da 26 popolazioni differenti. In questo progetto, gli individui di controllo sono stati sequenziati con il sequenziamento del genoma a basso coverage (con una copertura media di 7,4x) accompagnato dal sequenziamento dell’esoma con coverage medio di 65,7x. Sorprendentemente, il sequenziamento del genoma a basso coverage si è dimostrato in grado di  identificare le CNV in maniera corretta nei campioni di DNA.

Tieniti forte, ora entriamo nei dettagli tecnici!

Un LPGS condotto su un campione di DNA umano con un coverage dello 0,5x dovrebbe produrre almeno una read su 33 milioni degli 85 milioni di siti presenti nel progetto 1000 Genomi, laddove, invece, una genotipizzazione con CMA riesce a identificare un numero di varianti di uno o due ordini di grandezza inferiore. Inoltre, nell’LPGS non c’è l’errore sistematico in fase d’identificazione della variante poiché funziona indipendentemente dalla regione del DNA in cui si trovano le varianti.

Inoltre, i risultati della CMA dipendono dalla densità delle sonde dell’array, mentre il sequenziamento dell’intero genoma dovrebbe mappare la CNV attraverso l’intero DNA umano.

In uno studio, l’LPGS è stato utilizzato per l’analisi delle CNV su una coorte di 1077 coppie con poliabortività in parallelo con analisi cromosomiche standard. Gli autori sono stati in grado di trovare anomalie cromosomiche anche nelle coppie che in precedenza avevano ricevuto un cariotipo normale. Dunque, l’LPGS ha portato ad un incremento del tasso di successo diagnostico (Dong et al., 2019).

Il low-pass GS è stato anche valutato rispetto al CMA nella diagnostica prenatale.  L’LPGS non solo ha identificato tutti i riarrangiamenti cromosomici rilevati dai microarray, ma ha rilevato anomalie cromosomiche aggiuntive in altri casi. Utilizzando i risultati CMA come riferimento, il low-pass genome sequencing ha mostrato una sensibilità del 99.9% e una specificità dell’87.7%. Questi risultati suggeriscono che l’LPGS potrebbe essere applicato come test diagnostico prenatale alternativo (Wang et al., 2019).

Inoltre, l’LPGS ha mostrato la sua efficacia anche nel rilevare le CNV a mosaico. Più precisamente, se la dimensione della variante strutturale è maggiore di 2,5 Mb, l’LPGS potrebbe identificare CNV con una percentuale di mosaico inferiore al 20%.

Studi recenti hanno convalidato il LPGS come metodica alternativa, più economica e a maggior risoluzione rispetto alla CMA per l’identificazione delle CNV. Testato su centinaia di campioni per l’identificazione di microdelezioni/microduplicazioni, isodisomia uniparentale, triploidia e aneuploidie dell’intero cromosoma, l‘LPGS ha mostrato accuratezza, precisione, specificità e livelli di sensibilità tali da consentire l’identificazione di tutte le CNV precedentemente identificate con la CMA. Ciò ha portato a pensare che il LPGS possa essere la nuova tecnologia all’avanguardia per l’identificazione delle CNV, con costi inferiori e una risoluzione maggiore, forse in sostituzione al CMA come gold standard per l’analisi dei CNV.

La Breda Genetics ha avviato una review sistematica interna della letteratura riguardante l’utilizzo del LPGS nello screening delle CNV. Stanno emergendo le seguenti prove:

– costi accessibili;
– 100% di precisione, accuratezza, specificità e sensibilità (usando come riferimento i dati CMA);
– maggiore capacità di detection di riarrangiamenti cromosomici rispetto all’analisi microarray, con un aumento del tasso di successo diagnostico;
– possibile identificazione delle CNV a mosaico;
– applicazione nell’ambito dei test genetici prenatali e postnatali.

Sebbene siano necessari ulteriori studi per confermare queste buone premesse, il sequenziamento del genoma a basso coverage si sta dimostrando un metodo potente che potrebbe diventare il nuovo gold standard nell’analisi dei CNV.