Turnaround time nei test genetici per le malattie rare

Se sei interessato a tutti i passaggi che compongono l’intero processo di Next Generation Sequencing, puoi leggere il nostro post  qui. Vogliamo riassumere tutti i passaggi principali, che possono darti un’idea del tempo necessario per eseguire un’analisi di sequenziamento ad alta resa (nell’esempio seguente: sequenziamento dell’intero esoma): (1) estrazione del DNA da sangue o da altro supporto, (2) controllo della qualità del DNA (solitamente tramite Nanodrop o PicoGreen), (3) preparazione della libreria di DNA, (4) controllo della qualità della libreria, (5) cattura dell’esoma (la fase di cattura delle regioni codificanti del genoma umano, che sono le regioni che vogliamo sequenziare e leggere con questa tecnica), (6) controllo della qualità del capturing, (7) sequenziamento, che porta alla produzione dei dati grezzi (i cosiddetti file FASTQ), (8) controllo della qualità dei dati grezzi, (9) analisi bioinformatica secondaria (produzione di file di allineamento, a partire dai file FASTQ, e produzione del file di identificazione delle varianti – cosiddetto vcf), (10) analisi bioinformatica terziaria (filtraggio del vcf per escludere le regioni indesiderate e annotazione del vcf stesso sulla base dei maggiori database per le malattie e le mutazioni, per ottenere l’elenco delle varianti da interpretare). Dopodiché, arriviamo alla fase molto delicata (11) dell’interpretazione clinica dei risultati incentrata sui dati clinici del paziente (la cosiddetta analisi fenotipica). Questa è una fase molto lunga, tutta basata sull’esperienza del Clinical Scientist e sul know-how del genetista medico.

Personalmente non ho assolutamente alcun pregiudizio riguardo l’intelligenza artificiale ad alto funzionamento (A.I.) e sarei molto contento se un computer fosse in grado di scoprire la mutazione patogena di un paziente in pochi secondi, senza errori e senza falsi negativi. Il punto è che semplicemente non siamo ancora a quel livello di potenza artificiale. Nella nostra pratica presso Breda Genetics, abbiamo testato diverse eccellenti piattaforme di bioinformatica, con diversi algoritmi di prioritizzazione delle varianti, ma nessuna di loro ha mai raggiunto la sensibilità dell’interpretazione umana. Pur essendo di aiuto in alcuni casi, in altri non è raro che anche il miglior algoritmo manchi nell’identificazione della variante patogena di un paziente. Quindi, tornando al turnaround time dei test genetici clinici, il lavoro umano è un fattore chiave. E il lavoro umano è probabilmente la variabile più critica nel calcolo del tempo previsto per un’analisi genetica, insieme ad altri fattori molto importanti come il carico di lavoro del laboratorio e gli arretrati.

Come detto sopra, il lavoro umano è probabilmente il vero collo di bottiglia in qualsiasi laboratorio. Considerando anche gli alti costi del lavoro umano specializzato, è inevitabile che la maggior parte dei laboratori mantenga il team scientifico su quella che ritengono essere la migliore massa critica (cioè non troppo pochi, non troppo tanti). La conseguenza immediata è che un improvviso aumento degli ordini ha come conseguenza l’allungamento del turnaround time.

Considero che un buon TAT per il sequenziamento dell’intero esoma, in condizioni normali, sia questo: 6-8 settimane (30-40 giorni lavorativi). Il TAT per il sequenziamento dell’intero genoma? Questo è divertente! Poiché la maggior parte dei laboratori di sequenziamento ha ordini per il sequenziamento dell’esoma, i dati grezzi di sequenziamento dell’intero genoma possono essere pronti anche con un TAT inferiore a quello dell’esoma. Tuttavia, l’onere del lavoro umano per l’interpretazione del sequenziamento dell’intero genoma rimane considerevole, quindi il TAT finale non sarebbe troppo diverso (o anche più lungo) del sequenziamento dell’intero esoma. Molti fattori possono influenzare il TAT standard: (1) se il laboratorio esternalizza il suo sequenziamento (viene solitamente impiegata almeno una settimana o più solo per il controllo di qualità del DNA e 2-4 giorni sono necessari per il viaggio del campione e lo sdoganamento), (2) se il laboratorio deve seguire molte altre attività di routine, dalla consulenza genetica ad altri tipi di test (es. citogenetica), (3) le macchine (piattaforme di sequenziamento) gestite dal laboratorio: poiché la maggior parte delle piattaforme di sequenziamento, per essere redditizia, deve lavorare a pieno carico (proprio come gli aeroplani!), i laboratori con macchine più piccole possono iniziare immediatamente e offrire TAT più brevi, mentre i laboratori con apparecchiature più grandi (ad esempio Illumina Novaseq) possono necessitare di TAT più lunghi, a meno che non abbiano un’attività mondiale che gli consenta raccogliere campioni da tutto il mondo. L’utilizzo di macchine più piccole può offrire un TAT più breve, ma l’effetto collaterale è solitamente il prezzo finale, poiché eseguire un esoma su piattaforme piccole è molto costoso.

Alcuni laboratori tradizionali con le proprie apparecchiature sono davvero in grado di offrire incredibili TAT di 2-3 settimane. Tuttavia, dobbiamo sempre ricordare che un TAT più breve non è sempre una garanzia di qualità nei risultati.

Il sequenziamento Sanger per una o due mutazioni (ad esempio nel contesto di studi sulla segregazione familiare per varianti identificate con il sequenziamento dell’intero esoma) può essere sicuramente più rapido, con un TAT che va da 3 a 10 giorni lavorativi al massimo (a volte il TAT del sequenziamento Sanger è più lungo perché la prima coppia di primer disegnati per isolare la mutazione non funziona e lo scienziato deve disegnarne una seconda coppia). MLPA, che in definitiva è un’applicazione Sanger e si avvale di kit prefabbricati disponibili in commercio, di solito ha un TAT di 3-4 settimane. La qPCR (PCR quantitativa) per la ricerca di grandi delezioni/duplicazioni richiede in genere molto più tempo, poiché è un test molto personalizzato: 7-10 settimane per una qPCR non sarebbero un’eccezione.

I test genetici per malattie rare sono raramente una questione di emergenza, anche se a volte possono essere urgenti, specialmente nel contesto della diagnosi prenatale. Consiglierei di scegliere un laboratorio in base alla sua reputazione in termini di qualità dei risultati piuttosto che in termini assoluti di TAT. È certamente innegabile che risultati più rapidi siano vantaggiosi per tutti (il paziente in primis), tuttavia il sequenziamento del DNA non è ancora agli standard dei sogni di Hollywood, dove si può immaginare di ottenere un referto medico in pochi minuti dai capelli di un paziente. La qualità richiede lavoro, impegno, dedizione e, sì, anche il tempo per aiutare altri laboratori con le nostre conoscenze (vedi le proposte di Breda Genetics nel database ClinVar).