INTERO&TARGETED
La diagnostica molecolare può essere ad oggi suddivisa in strategia “intera” (sequenziamento dell’intero esoma o dell’intero genoma) o strategia “targeted” (sequenziamento di un singolo gene o di un pannello). I metodi per l’identificazione delle CNV variano notevolmente a secondo dell’approccio desiderato. Qui sotto vi guidiamo alla scelta giusta (con le tecniche che abbiamo scelto).
STRATEGIE “INTERE”
Tecnologia dei microarray (array-CGH and SNP-array)
La tecnologia dei microarray si basa sull’ibridazione di segmenti di DNA target con sonde specifiche immobilizzate su un supporto solido. L’avvenuta ibridazione viene evidenziata dall’emissione di luce fluorescente. L’array-CGH e lo SNP-array sono le tecnologie di microarray più comuni. Attualmente, le linee guida ACMG raccomandano di eseguire l’array-CGH come primo step in tutti i pazienti affetti da ritardo mentale e anomalie congenite complesse. Tuttavia, i microarray non sono in grado di identificare riarrangiamenti bilanciati o localizzati in regioni cromosomiche duplicate (per questo proposito è necessario usare la FISH – vedi sotto).
Tecnologia NGS
la tecnologia NGS (Next Generation Sequencing) è basata sul sequenziamento di molecole di DNA altamente frammentate. Ciascun frammento di DNA può essere sequenziato numerose volte (coverage) producendo numerose “reads”. Il numero di reads prodotte può essere utilizzato per calcolare “il dosaggio” di un particolare frammento di DNA e per identificare la presenza di qualche CNV. Questi calcoli sono fatti da sofisticati algoritmi che comparano la copertura dei frammenti di DNA adiacenti nello stesso campione o in un pool di campioni controllo.
STRATEGIE “TARGETED”
La strategia “targeted” consiste nell’analisi di un singolo gene o un gruppo di geni (sia quando questi geni sono adiacenti che quando sono distribuiti lungo il genoma).
FISH (Flourescent In Situ Hybridization)
La FISH può essere classificata come tecnica molecolare di citogenetica. Le sonde marcate con dei fluorocromi sono fatte ibridare ai cromosomi in una piastra per vedere se una certa regione cromosomica presenta una CNV o una traslocazione. Come tale, la FISH può identificare facilmente se la regione target è deleta, duplicata (o moltiplicata per un qualsiasi numero di volte) e/o se è traslocata in un’altra posizione cromosomica. La FISH è una tecnica semplice, intuitiva e molto ben validata, con alti livelli di sensibilità e specificità, ma non può identificare piccoli sbilanciamenti e non può essere utilizzata per screenare l’intero cariotipo (è necessario sapere a priori quale regione cromosomica si vuole testare per cercare la sonda appropriata all’utilizzo).
qPCR
La qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) è una tecnica utilizzata da tempo per identificare delezioni o duplicazioni di una regione di DNA selezionata. La qPCR permette di monitorare l’amplificazione del DNA ad ogni passaggio della reazione (e per questo motivo è chiamata real-time PCR o rtPCR). Il monitoraggio è possibile grazie all’utilizzo di sonde fluorescenti.
MLPA
Prova a vedere la nostra pagina sulle 10 domande più frequenti sull’MLPA. MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification) è probabilmente la tecnica più usata per l’identificazione di grandi delezioni/duplicazioni di geni selezionati. La sua popolarità è dovuta alla sua semplicità, alla sua rapida esecuzione, alla sua robustezza e al rapporto costo/beneficio. MLPA si basa sull’ibridazione di regioni target di DNA con sonde complementari, seguita da PCR multiple con una singola coppia di primers fluorescenti. Parenti dell’MLPA sono:
MAPH (Multiplex Amplification and Probe Hybridization), dove il DNA è immobilizzato su una membrana e ibridato a una serie di sonde target. La membrana viene poi lavata, le sonde ibridate vengono amplificate con la PCR e i prodotti della PCR separati attraverso l’elettroforesi.
MAQ (Multiplex Ampliccon Quantification), che si basa su PCR multiple che producono ampliconi fluorescenti della regione di DNA di interesse e di regioni di DNA controllo. I prodotti della PCR vengono poi separati da un sequenziatore a capillari.
Southern blot
Nato negli anno ’70, il southern blot (o southern blotting) è ancora oggi utilizzato per l’identificazione di alcuni tipi di CNV, in particolare per la diagnosi delle malattie da espansioni ripetute, per trovare un numero alto o molto alto di ripetizioni. Il DNA target viene frammentato attraverso l’utilizzo di un’endonucleasi e i frammenti vengono separati con elettroforesi su una membrana di nylon o nitrocellulosa. Sonde di DNA specifiche sono marcate con l’incorporazione di molecole radioattive o targate con molecole fluorescenti o cromofore e sono miscelate al DNA precedentemente frammentato. Dopo l’ibridazione, le sonde in eccesso sono lavate via dalla membrana (di solito usando il buffer SSC) e il pattern di ibridazione viene visualizzato su una lastra ai raggi-X attraverso l’autoradiografia nel caso di sonde radioattive o fluorescenti, o dallo sviluppo del colore se è stato usato il metodo cromogenico.
Nanostring
Prodotto e commercializzato da Nanostring Technologies, questo metodo è molto flessibile e può essere utilizzato sia per gli studi di espressione che per l’analisi delle CNV, si dell’RNA che del DNA. Si tratta di una tecnologia di conteggio digitale, molto simile a RNA-seq o NGS. Ciascun gene di interesse viene quantificato e collegato a un codice a barre ottico che funge da identificatore univoco di quel particolare gene. La tecnologia si basa sull’utilizzo di codici a barre ottici. I codici a barre ottici vengono quindi identificati e contati utilizzando una flow-cell su uno strumento specifico (nCounter).
Breda Genetics srl
Breda Genetics srl crede nella robustezza e nella riproducibilità dell’MLPA per l’identificazione di delezioni/duplicazioni per singoli geni e pannelli e in EXOME D o array-CGH per lo studio dell’intero genoma.
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Vedi anche:
