Next Generation Sequencing

Pochi semplici passi per spiegare la NGS

Next Generation Sequencing | Breda Genetics srlDopo anni in cui il Sanger sequencing ha rappresentato il gold standard della diagnostica genetica molecolare mondiale, le tecniche di nuova generazione (Next Generation Sequencing – NGS, detta anche second generation sequencing) hanno preso il sopravvento. La NGS è anche chiamata high-throughput sequencing (sequenziamento ad alta resa) perchè, a differenza del sequenziamento tradizionale col metodo Sanger, consente di sequenziare moltissimi frammenti in parallelo. Esistono diversi sistemi NGS, sviluppati da diverse compagnie. Tutti questi sistemi, tuttavia, condividono almeno tre passi fondamentali: la preparazione e immobilizzazione del DNA (cioè la preparazione della cosiddetta sequencing library), la reazione di amplificazione e la reazione di sequenziamento. Riassumendo, la Next Generation Sequencing si caratterizza per:

1. Preparazione della sequencing library
2. Amplificazione
3. Sequenziamento

Vediamo ciascuno step più nel dettaglio:

1. PREPARAZIONE E IMMOBILIZZAZIONE DEL DNA (OVVERO CREAZIONE DELLA SEQUENCING LIBRARY)

Il campione di DNA viene preparato attraverso un processo di frammentazione casuale. Ai frammenti casuali così ottenuti vengono aggiunte delle sequenze predefinite (note come ‘adattatori’ o  adaptors) che sono necessarie per ancorare e immobilizzare i frammenti al supporto sul quale avrà luogo la reazione di sequenziamento. I frammenti di DNA così preparati tramite l’aggiunta degli adattatori costituiscono la cosidetta libreria di sequenziamento (sequencing library). Esistono almeno tre diversi tipi di adattatori e quindi tre diversi modi di preparare la sequencing library: adattatori lineari, adattatori circolari e adattatori a bolla. Esistono naturalmente anche tipi di supporto di ancoraggio diversi: ad esesmpio, nel sistema SOLiD i frammenti vengono ancorati ad una lastra di vetro.

Figura 1: rappresentazione schematica di una sequencing library per la next generation sequencing: a: supporto; b: adattatori; c: frammenti di DNA ancorati al supporto (immobilizzati) tramite gli adattatori.

Fig. 1: rappresentazione schematica di una sequencing library per la next generation sequencing: a: supporto; b: adattatori; c: frammenti di DNA ancorati al supporto (immobilizzati) tramite gli adattatori.

 2. AMPLIFICAZIONE

L’amplificazione può essere fatta in emulsione (sistema Roche e sistema SOLiD) o in soluzione. Ad esempio, nel sistema GS FLX (Roche) un frammento della sequencing library viene incorporato in una microscopica bolla di acqua assieme a dei cosiddetti enrichment beads, che sono praticamente delle piccole sfere a cui gli adattatori si possono legare. La reazione di amplificazione (PCR) viene fatta in questa microbolla acquosa, all’interno della quale il frammento di DNA viene amplificato numerose volte. Le copie clonali del frammento si legano poi all’enrichment bead ricoprendone la superficie. Gli enrichment beads così ottenuti vengono poi depositati sulla cosiddetta piastra Picotiter.

3. SEQUENZIAMENTO

Il sequenziamento avviene grazie a complessi meccanismi fluidici che, funzionando su scala microlitrica, regolano il flusso dei reagenti che vanno a cimentarsi col DNA immobilizzato. Ogni ciclo di sequenziamento consiste nel cimentare il DNA immobilizzato con una soluzione contenente un nucleotide (che, se complementare alla sequenza, viene incorporato), un successivo lavaggio e la registrazione dell’evento molecolare appena verificatosi. La registrazione dell’evento molecolare avviene con un sistema per immagini (imaging; nel sistema GS FLX Roche, ad esempio, la reazione di incorporazione del nucleotide nel filamento complementare crescente avviene in concomitanza dell’emissione di un lampo di luce, da ciò il nome di pyrosequencing, dal greco antico pyros, che significa fuoco). Fa eccezione al sistema di registrazione per immagini la macchina Ion Torrent (Life Technologies) che, basata su un sistema di rilevazione con semiconduttore, riconosce l’emissione di ioni idrogeno che vengono rilasciati durante la reazione di polimerizzazione del DNA.

Come detto all’inizio, i sistemi NGS sono anche detti high-throughput (ad alta resa) perchè tutti i frammenti immobilizzati sul supporto di sequenziamento vengono sequenziati in parallelo (a differenza del Sanger sequencing tradizionale, in cui si può sequenziare un solo frammento per volta).

Solo alcuni dettagli su come viene generata la catena in allungamento, cioè su come vengono incorporati i nucleotidi nei diversi sistemi: nel pyrosequencing del sistema GS FLX Roche e nel sistema Ion Torrent (Life Technologies) ogni nucleotide viene interrogato singolarmente. Nei sistemi Illumina i quattro nucleotidi vengono interrogati in parallelo, ma solo il nucleotide terminatore complementare (terminator nucleotide) si lega, poiché ognuno dei quattro nucleotidi terminatori dispone di un parte che inibisce il legame degli altri tre. Il sistema PacBio RS si basa, invece, sull’utilizzo di nucleotidi che recano un fluoroforo clivabile (rimovibile) che viene staccato durante la reazione di incorporazione. I sistemi SOLiD e CGA utilizzano invece un sistema di sequenziamento che fa uso di oligonucleotidi degenerati marcati con fluorocromi.

Una volta completato il sequenziamento, i dati verrano analizzati nella fase computerizzata di analisi bioinformatica (alignment, variant calling, filtering and annotation).

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