Se non sei un genetista e ti devi approcciare al mondo dei test genetici, potresti avere qualche difficoltà nella scelta del miglior test per il tuo paziente.
Negli ultimi anni, grazie all’avanzamento delle tecnologie di Next- Generation Sequencing (NGS), all’abbassamento dei loro costi e all’aumento delle conoscenze sulle malattie genetiche, l’esecuzione di un test genetico sta diventando sempre più uno dei punti fermi del processo diagnostico.
Ma qual è il test più appropriato per il fenotipo del mio paziente? Qual è quello più rapido e con i miglior rapporto qualità-prezzo?
Ricorda: la scelta giusta permetterà di risolvere l’odissea diagnostica del tuo paziente nel minor tempo possibile!
Facciamo un passo indietro…
Le linee guida italiane impongono che un qualsiasi test genetico venga prescritto solo e soltanto da un medico genetista, in seguito ad una approfondita consulenza genetica, nella quale vengono indagate la storia familiare del paziente, la sua anamnesi, la presenza di segni fisici e tutto ciò che può essere utile per chiarire il sospetto diagnostico.
In altre parti del mondo, è possibile che la prescrizione del test genetico venga invece eseguita anche da altri professionisti sanitari, che possono non avere le competenze sufficienti per la scelta corretta del test a cui sottoporre un certo paziente.
Ecco dunque alcune informazioni su alcuni dei principali test genetici utilizzati, sulle loro applicazioni, limitazioni, tempi di risposta (TAT) e performance.
In generale, la scelta del test è strettamente legata alla presentazione clinica del paziente. Il fenotipo è altamente suggestivo per una malattia monogenica? In questo caso, grazie a costi e tempi contenuti, conviene testare il singolo gene. Il paziente ha una malattia di difficile inquadramento diagnostico? Meglio procedere con il sequenziamento dell’intero esoma. Il paziente potrebbe avere un riarrangiamento cromosomico? Non dimentichiamoci del cariotipo…
Test citogenetici
1. CMA (Chromosomal MicroArray)
Il CMA è una tecnica non specifica che permette di identificare grandi delezioni/duplicazioni lungo tutto il genoma, e che viene utilizzato come gold standard per l’analisi di patologie quali disturbi del neurosviluppo, autismo o ritardo mentale e malformazioni congenite multiple. Il CMA ha una risoluzione di circa 25Kb (a seconda della distanza media delle sonde), una resa diagnostica che va dal 15% al 20% e un TAT di 2-6 settimane. Il CMA ha per molti versi sostituito il cariotipo, grazie alla maggior risoluzione e resa diagnostica, ma è importante ricordare che non è in grado di identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati e CNV di dimensioni <10Kb.
2. Cariotipo
Il cariotipo (o mappa cromosomica) per mette di visualizzare la mappa del corredo cromosomico di una cellula, e viene utilizzato per identificare aneuploidie cromosomiche (come la trisomia 21) e la presenza di grandi riarrangiamenti cromosomici come traslocazioni e inversioni (anche bilanciate). Viene utilizzato anche per valutare il rischio riproduttivo in famiglie con una storia positiva per aneuploidie o traslocazioni o nel caso di aborti ricorrenti. Ha una resa diagnostica abbastanza bassa (~3%) e anche una bassa risoluzione (3-5 Mb). Il tempo di risposta è di 1-2 settimane.
Test di sequenza
1. Sequenziamento di un solo gene, un pannello di geni, l’intero esoma
Se inizialmente era molto meno costoso e più efficiente il sequenziamento di un singolo gene o di pochi geni a seconda del fenotipo del paziente, ad oggi la diagnostica genetica si sta spostando sempre più verso l’applicazione del sequenziamento dell’intero esoma (whole exome sequencing, WES).
Il sequenziamento del singolo gene può essere applicato nel caso in cui vi sia un forte sospetto diagnostico per una malattia monogenica (ec. Fibrosi cistica), con tempi di risposta abbastanza brevi (1-4 settimane) e una resa diagnostica che può raggiungere il 100% (a seconda della patologia). Il problema principale è che pochissime condizioni sono monogeniche.
Lo step successivo in termini di dimensioni è il sequenziamento di un gruppo di geni (pannello) relati ad un determinato fenotipo. I pannelli possono essere già prestabiliti o personalizzabili, hanno tempi di risposta brevi (2-6 settimane) e sono consigliati quando il sospetto clinico è forte e la diagnosi differenziale breve. Il problema maggiore dei pannelli target è che sono “immutabili” e nel caso in cui venga scoperto un nuovo gene per quel fenotipo devono essere ridisegnati. Per questo in molti laboratori, compreso Breda Genetics, si preferisce l’applicazione di “pannelli virtuali” a partire da dati di sequenziamento che derivano dall’intero esoma o dall’intero genoma.
Il sequenziamento dell’intero esoma permette di identificare piccole variazioni di sequenza nelle regioni codificanti dei geni. Inoltre, recentemente, molti laboratori hanno messo a punto algoritmi specifici per poter identificare le CNV a partire dai dati di sequenziamento, permettendo di aumentare ulteriormente la resa diagnostica del WES (che si aggira attorno al 30-45%). Il WES viene consigliato nei casi in cui il sospetto clinico non è definito o vi è una lunga lista per la diagnosi differenziale. Il TAT è più lungo di quello delle analisi precedenti (5-12 settimane) e anche il costo è maggiore. Le principali limitazioni sono l’aumentata probabilità di identificazione di VUS (variant of unknown significance) e la difficoltà nell’interpretazione delle varianti non codificanti, oltre che la possibilità di imbattersi in incidental findings.
2. Sequenziamento dell’intero genoma (WGS, whole genome sequencing)
Il sequenziamento dell’intero genoma può essere utilizzato in alternativa al WES o quando il WES è negativo. Permette infatti di identificare non solo le varianti esoniche, ma anche quelle introniche, aumentando in questo modo la resa diagnostica. Inoltre, permette di identificare anche i riarrangiamenti strutturali e di mappare in modo preciso i punti di rottura. I principali limiti del WGS, oltre il costo che è abbastanza alto e al TAT che aumenta notevolmente (4-16 settimane), è la difficoltà nel maneggiare una grande quantità di dati e nell’interpretare numerose varianti (VUS).
Altri test
1. Test per espansione di triplette
Alcune malattie sono dovute all’espansione del numero di una tripletta che si trova in una particolare regione del gene. In queste patologie, il numero di triplette può essere abbastanza variabile e viene suddiviso in 3 fasce: un range di normalità, uno stato di premutazione e un range di mutazione, in cui la malattia è conclamata. Purtroppo il sequenziamento NGS non può fornire dati attendibili in queste regioni altamente ripetute e sono necessari test specifici per la valutazione del numero di triplette presenti. Il limite principale è che bisogna conoscere a priori la diagnosi del paziente per procedere con la conferma molecolare. Il tempo di risposta è di 2-4 settimane.
2. Test di metilazione
Altre patologie sono caratterizzate da un’anomalia del pattern di metilazione di alcune regioni di controllo del gene. Trattandosi di modificazioni epigenetiche, non possono essere identificate dal solo WES e sono invece necessarie tecniche specifiche come l’MS-MLPA. Questa tecnica viene consigliata nel caso di sospetto di malattia da imprinting o di disomia uniparentale, ha un tempo di risposta da 2 a 4 settimane e una resa diagnostica variabile.
Bibliografia
Taylor A, Alloub Z, Tayoun AA. A Simple Practical Guide to Genomic Diagnostics in a Pediatric Setting. Genes (Basel). 2021 May 27;12(6):818. doi: 10.3390/genes12060818. PMID: 34071827
Yang M, Xu B, Wang J, Zhang Z, Xie H, Wang H, Hu T, Liu S. Genetic diagnoses in pediatric patients with epilepsy and comorbid intellectual disability. Epilepsy Res. 2021 Feb;170:106552. doi: 10.1016/j.eplepsyres.2021.106552. Epub 2021 Jan 7. PMID: 33486335.
