Qual è stata l’evoluzione dell’esoma come applicazione diagnostica negli ultimi 5 anni?
L’adozione dell’analisi dell’esoma (whole exome sequencing – WES) negli ultimi 5 anni è stata in parte dovuta all’introduzione di questa metodica in alcune linee guida dei sistemi sanitari (limitatamente ad alcuni paesi) e in parte all’evidenza del suo tasso di successo diagnostico, che lo ha reso di prima scelta in alcune situazioni. Ad esempio, nel 2021 l’ACMG (American College of Medical Genetics) ha pubblicato una linea guida evidence-based che raccomanda l’esoma come test di prima/seconda linea per pazienti pediatrici con anomalie congenite, deficit di sviluppo e ritardo mentale.In inghilterra, invece, lo NHS Genomic Medicine Service ha implementato a livello nazionale l’analisi dell’esoma prenatale (prenatal exome) per feti con anomalie nell’ottobre 2020: si tratta di un passo importante, che formalizza l’uso clinico del WES in un setting sensibile come quello prenatale.
Passano invece al mondo reale, esistono una serie di pubblicazioni che mettono in evidenza come il tasso di successo diagnostico (stimato ora fra il 25% e il 40%) abbia favorito l’adozione dell’analisi dell’esoma (sia singleton che trio) non solo nei laboratori pubblici, ma anche nei laboratori privati, a testimonianza di una richiesta sempre in crescita per questo test genetico, che è sempre più completo ed affidabile nella diagnosi delle malattie genetiche. Ad esempio, già nel 2023 il giornale scientifico JAMA indica come l’uso del WES su ampie popolazioni cliniche non selezionate rappresenti l’indice di passaggio da test “di nicchia” a test di popolazione clinica per specifiche indicazioni.
Come valutare il laboratorio migliore dove far eseguire l’analisi dell’esoma?
Diversi sono gli aspetti da tenere in considerazione, oltre al nome dela laboratorio, l’esperienza nota nel campo della diagnosi delle malattie rare e altri aspetti come l’autorizzazione e l’accreditamento, che consentono la consegna di documenti a valore diagnostico. Volendo entrare più nello specifico dei dettagli clinici e tecnici, anrebbero valutati almeno alcuni dei seguenti aspetti:
- Copertura: ≥95–98% delle regioni codificanti a ≥20× (meglio se indicano anche ≥30×). Profondità media ≥80–100×. 20x indica il numero di volte in cui un segmento di DNA viene letto dal sequenziatore (in questo caso 20). Gli esomi migliori hanno coperture che vanno da 90x a 140x sulla maggior parte del DNA sequenziato.
- Kit e pipeline: kit di cattura (o, in inglese, capturing o enrichment) usato, specialmente per capire se il laboratorio sta offrendo l’esoma cosiddetto clinico (cioè limitato ai soli 6.000 geni noti fin qui per essere associati a malattia) o il vero esoma intero (whole exome sequencing) contenente tutti i 20.000 geni umani, compresi quelli di più recente pubblicazione negli studi associazione gene-malattia.
- Spettro di varianti: quali varianti può identificare l’esoma eseguito? Solo le mutazioni di singolo nucleotide (SNV/indel) o anche le mutazioni di grandi dimensioni (CNV – Copy Number Variations) a livello intra-esonico/mono-esonico?
- Opzioni extra sui tipi di varianti identificate: mtDNA (copertura e limiti), ripetizioni espansionali (se incluse o come reflex), analisi di splicing (predittori + RNA se disponibile).
- Interpretazione clinica: viene utilizzata la classificazione delle varianti genetiche standardizzata dalle linee guida ACMG/AMP?
- Report di VUS (Variant of Uncertain Signficance): il laboratorio riporta anche le varianti di significato incerto che potrebbero essere associate alla malattia, dando quindi ulteriori spunti di riflessione, in caso di esito negativo del test, circa la possibile diagnosi differenziale?
- Fenotipizzazione (HPO): quanto e come integrano fenotipo clinico e imaging? L’informazione clinica viene sapientemente sintetizzata in termini HPO, e la bioinformatica è strutturata per la prioritizzazione delle varianti sulla base del fenotipo clinico del paziente?
- Reporti secondari incidentali: adesione alle liste ACMG (opt-in/opt-out per pediatrici).
- Re-analisi: se prevista; ogni 12–24 mesi o al sopraggiungere di nuovi dati, e a quali costi.
- ClinVar & trasparenza: politiche di sottomissione varianti, recontact se emerge nuova evidenza.
Cosa è cambiato dai primi esomi?
L’esoma, inteso come sequenziamento e analisi in parallello di tutti i 20.000 geni umani, è apparso a scopo di ricerca nel 2009 e nel 2011 sono stati introdotti i primi test commerciali a scopo diagnostico. Da allora molto è migliorato, sia per quanto rigaurda i kit diagnostici di cattura (o arricchimento – enrichment che dir si voglia) sia per quanto riguarda la Bioinformatica.
Per i primi esomi, la comunità medica era solita accettare come sufficientemente affidabile una copertura di soli 30x sulla maggior parte del target di cattura. Ora lo standard è aumentato, soprattutto grazie alla riduzione dei costi. Basti pensare che i primi esomi commerciali erano venduti anche a 7.000 € a paziente! Un buon esoma oggi viene sequenziato ad un profondità di lettura di almeno 90x, idealmente fino a 120-140x.
Col tempo e l’aumento delle conoscenze sulle sequenze genomiche, sono state migliorate anche le sonde per poter catturare tutti i geni umani in modo più efficiente e con minor sforzo di sequenziamento. Ciò che si legge oggi è quindi un’esoma più esteso e allo stesso tempo meno pesante in termini di milioni di basi sequenziate.
La Bioinformatica è molto migliorata e il mercato è ormai ricco di soluzioni user-friendly, che forniscono piattaforme per la lettura più intuitiva delle varianti genetiche. Quasi tutte le piattaforme bioinformatiche a pagamento offrono oggi la possibilità di creare un database con tutti gli esomi sequenziati nell proprio laboratorio, la possibilità di vedere a colpo d’occio tutte le caratteristiche biologiche fondamentali e i riferimenti bibliograifici cruciali di geni e mutazioni. Non solo: rispetto all’inizio, la bioinformatica è ora in grado di rilevare non solo le SNV (cioè le piccole varianti di singolo nucleotide), ma anche le CNV (cioè le varianti di grandi dimensioni, che vengono identificate comparando l’intensità del segnale di sequenziamento di quel particolare campione in comparazione a quello proveniente da tutti gli altri campioni del laboratorio, sequenziati con lo stesso kit di cattura). In fase avanzata sono anche gli algoritmi bioinformatici in grado di rilevare le UPD (Uni Parental Disomy) e l’espansione di elementi ripetuti.
In sintesi, com’è cambiata l’analisi dell’esoma e quali vantaggi offre rispetto al passato?
Dai primi esomi del 2009, possiamo riassumero così i vantaggi acquisiti dalla tecnica Whole Exome Sequencing, che già era nata con le migliore premesse di analisi genetica d’elezione per gli anni a venire:
- Crescita dell’accuratezza clinica e della standardizzazione
- Miglioramento tecnologico e ampliamento analitico
- Riduzione dei costi tecnici
Purtroppo non sempre questi miglioramenti si sono accompagnati ad una maggior accessibilità a questa formidabile tecnica diagnostica che, ancora in diversi contesti e in diversi paesi, rimane ancora di difficile da ottenere. La direzione sempre tuttavia tracciata. Specialmente nei casi di malattia rara, l’approccio tramite un pannello limitato a un piccolo numero di geni, salvo diagnosi già confermata clinicamente, non è più definibile come scelta d’elezione. Solo l’analisi dell’esoma (o eventualmente l’analisi del genoma – Whole Genome Sequencing) può garantire lo studio in parallello di tutti i 20.000 geni umani ed eliminare i tempi lunghissimi dell’odissea diagnostica.