Test Genetico Tumori
Attraverso l’analisi di famiglie con cancro al seno ricorrente e gli studi di popolazione, finora sono state identificate migliaia di varianti di sequenza nei geni BRCA1 e BRCA2. Un totale di 19.655 mutazioni e polimorfismi differenti sono riportati nel gene BRCA1 dal BRCA Exchange, mentre lo stesso database riporta 20.734 mutazioni uniche e polimorfismi nel gene BRCA2 (ultimo aggiornamento Gennaio 2021). Anche ClinVar ha un set di dati abbastanza ampio, riportando, nel 2021, 11.561 e 12.794 varianti per BRCA1 e BRCA2 rispettivamente, comprese mutazioni puntiformi e piccoli indel, variabilmente classificati come patogeni, probabilmente patogeni, incerti, associati alla malattia, probabilmente benigni o benigni e grandi riarrangiamenti genomici. Lo spettro mutazionale è quindi molto ampio, anche se alcune mutazioni founder possono essere trovate con una frequenza relativamente più alta rispetto ad altre varianti più rare in popolazioni selezionate.
Tipi di varianti
Le varianti in BRCA1 e BRCA2 possono essere suddivise in tre grandi classi: varianti a singolo nucleotide (SNV), piccole inserzione o delezione (indel) e grandi riarrangiamenti genomici (LGR). Le varianti patogene a singolo nucleotide e le piccole indel sono ampiamente distribuite nell’intera sequenza codificante e nelle regioni introniche di entrambi i geni. I grandi riarrangiamenti genomici comprendono grandi delezioni/duplicazioni di un singolo esone, di più esoni (multiesoniche) o dell’intero gene.
Per avere un’idea del tipo di mutazioni (e delle loro proporzioni) che si verificano nelle sequenze di BRCA1 e BRCA2, esiste un altro database (HGMD Public; ultimo aggiornamento dicembre 2020), che riporta i numeri come segue:
| Mutation Type | BRCA1 | BRCA2 |
| Missense/nonsense | 696 | 668 |
| Splicing | 199 | 166 |
| Regulatory | 17 | 1 |
| Small deletions | 661 | 780 |
| Small insertions | 234 | 267 |
| Small indels | 41 | 41 |
| Gross deletion | 245 | 57 |
| Gross insertion | 47 | 19 |
| Complex rearrangements | 22 | 9 |
| Repeat variations | 0 | 0 |
Sembrerebbe che nella sequenza del gene BRCA1 non ci siano hotspot mutazionali, sebbene una grande quantità delle mutazioni cada all’interno degli esoni 10-12, che sono molto importanti per la funzione di onco-soppressore di BRCA1. È noto che questa regione centrale di BRCA1 interagisce con numerose proteine coinvolte in un’ampia gamma di pathway cellulari come la trascrizione, la riparazione del DNA e la progressione del ciclo cellulare. I partner che interagiscono con BRCA1 includono la proteina retinoblastoma (Rb), c-Myc, RAD50 e RAD51. L’esone 10 contiene due sequenze di localizzazione nucleare (NLS) e codifica quasi il 60% della proteina BRCA1. Le sequenze NLS consentono l’interazione con l’importina-alfa, che media il trasporto di BRCA1 dal citosol al nucleo. Le mutazioni nelle NLS determinano uno spostamento verso la localizzazione citosolica di BRCA1 e il conseguente aumento delle mutazioni non riparate e delle anomalie cromosomiche nei tumori maligni.
Alcune mutazioni ricorrenti, principalmente derivanti da un effetto fondatore sono state identificate nei geni BRCA1 e BRCA2. È stata riportata la conservazione di un aplotipo comune. È anche stato riscontrato in famiglie differenti provenienti da regioni e comunità molto distanti, che le stesse mutazioni in BRCA1 sono spesso accompagnate dagli stessi markers polimorfici . Questo non solo suggerisce un effetto del fondatore piuttosto che la presenza di un hotspot mutazionale come base per le mutazioni ricorrenti, ma indica anche un alto grado di stabilità genetica in questo locus, con un tasso relativamente basso di nuove mutazioni. Mutazioni founder sono state identificate in molte popolazioni, come gli ebrei ashkenaziti, e in alcuni paesi come l’Islanda, la Norvegia, la Polonia, i paesi baltici, i Paesi Bassi e il Belgio. Ad esempio, tre mutazioni si trovano comunemente nella popolazione ebrea ashkenazita:
- c.68_69delAG (o 185delAG nella nomenclatura BIC) nel gene BRCA1;
- c.5266dupC (o 5382insC nella nomenclatura BIC) nel gene BRCA1;
- c.5946delT (or 6174delT nella nomenclatura BIC) nel gene BRCA2.
La mutazione c.68_69delAG in BRCA1 è stata trovata nel 20% delle donne ebree ashkenazite con diagnosi di cancro al seno prima dei 42 anni, mentre la mutazione c.5946delT in BRCA2 è presente nell’8% delle donne con diagnosi di cancro al seno prima dei 42 anni e nell’1,5% degli ashkenaziti non selezionati.
La mutazione c.771_775delTCAAA (o 999del5 nella nomenclatura BIC) in BRCA2 si verifica nello 0,6% della popolazione islandese e nel 10,4% delle donne e nel 38% degli uomini con cancro al seno dell’Islanda.
La prevalenza di mutazioni ricorrenti dovute a un effetto fondatore può influire sulla strategia di test in alcuni paesi.
Varianti di significato incerto (VUS)
L’interpretazione dei risultati dello screening di BRCA1 e BRCA2 è complicata dall’identificazione di varianti di significato clinico incerto (VUS). Quando viene trovata una VUS, la previsione sulla funzione della proteina e sul rischio di malattia rimane sfuggente. Varianti nelle regioni del promotore, cambiamenti nucleotidici intronici vicino alla giunzione esone/introne, piccole inserzioni/delezioni in-frame, varianti missenso e sinonime possono spesso essere classificate come VUS. La frequenza delle VUS è in generale inferiore nelle popolazioni ben caratterizzate, poiché i database vengono aggiornati frequentemente e le VUS precedenti sono spesso reinterpretate e riclassificate. I modi per aiutare a chiarire il significato clinico di una VUS includono quanto segue:
- test del portatore familiare nel maggior numero possibile di parenti informativi. Svelare il modello di segregazione è il primo passo per comprendere un VUS. Una variante che tende ad essere presente solo nei pazienti affetti e assente nei consanguinei non affetti ha sicuramente una maggiore probabilità di essere patogena piuttosto che benigna. Tuttavia, è necessaria cautela nell’interpretazione dei dati di segregazione, soprattutto a causa della penetranza incompleta e delle probabilità che la co-segregazione malattia-VUS sia casuale.
- studi funzionali, principalmente su RNA. Soprattutto nel caso di mutazioni putative di splicing, come varianti introniche o sinonime, gli studi sull’espressione dell’RNA possono rivelare l’effetto deleterio della variante sul messaggero (mRNA). Le varianti che alterano il processo di splicing, così come le mutazioni nonsenso che introducono un codone di stop prematuro, possono portare alla formazione di una proteina tronca o al nonsense-mediated messenger decay (NMD). NMD può essere studiato con studi di espressione allele-specifica, che sono possibili mediante qPCR o applicazioni di elettroforesi capillare (Sanger) (si veda, ad esempio, la tecnologia SNaPshot). Si richiede cautela anche negli studi funzionali, soprattutto a causa della notevole instabilità della molecola di RNA e dell’unicità dei protocolli di studio (ogni VUS richiede un progetto di studio completamente nuovo, che rimane in linea di principio “sperimentale” e largamente dipendente dall’operatore). Non tutti i laboratori sono attrezzati per procedere agli studi funzionali.
Mutazioni multiple in BRCA1 e BRCA2
Alcune famiglie con più di una mutazione patogena nei geni BRCA sono state riportate in letteratura. In particolare, sono state descritte famiglie con una mutazione in BRCA1 e una in BRCA2 o due mutazioni in BRCA1. Le mutazioni possono segregare singolarmente in diversi membri della famiglia, ma possono anche essere presenti in un paziente come doppie mutazioni eterozigoti. Heidemann et al., 2012 (PMID 22535016), hanno affermato che le femmine portatrici di una mutazione in BRCA1 e una in BRCA2 possono avere un esordio precoce del cancro al seno e avere una malattia più grave rispetto alle portatrici di mutazioni eterozigoti singole in BRCA. Al contrario, Lavie et al., 2012 (PMID 20924075), che hanno trovato doppi eterozigoti per una mutazione patogena in BRCA1 e in BRCA2 in un’ampia coorte di individui ebrei con una prevalenza dell’1,85%, hanno affermato che, nonostante un’età di esordio leggermente più giovane, quei pazienti non soffrono effettivamente di una malattia più grave di quelli con una sola mutazione. Da notare, Lavie e colleghi hanno evidenziato che, nella loro coorte, non sono stati identificati pazienti con due mutazioni in BRCA1, ipotizzando che un tale evento potrebbe non essere compatibile con la vita. Infatti, Stoppa-Lyonnet et al., 1996 (PMID 8755940), avevano precedentemente identificato una famiglia con due mutazioni in BRCA1, ma, anche in questo caso, non sono stati identificati membri della famiglia portatori di entrambe le mutazioni contemporaneamente. Curiosamente, Stoppa-Lyonnet et al. hanno osservato come gli studi di linkage possono fallire se non si sospetta un secondo allele patogeno in una famiglia. Un ulteriore descrizione di pazienti doppi eterozigoti è stata data da Leegte et al., 2012 (PMID 15744030): anche in questo caso gli autori hanno concluso che la doppia eterozigosi non sembra essere correlata ad un fenotipo più grave (hanno osservato che lo spettro clinico della doppia eterozigosi in BRCA va dal cancro al seno unilaterale con esordio a 26 anni alla sopravvivenza libera dal cancro all’età di 70 anni). Cortesi et al., 2003 (PMID 12673274), hanno riportato una famiglia con una mutazione in BRCA1 e una in BRCA2. Tuttavia, in questa famiglia, non sono riportati pazienti con doppia eterozigosi: tutti i pazienti affetti erano portatori o della mutazione in BRCA1 o della mutazione in BRCA2. Anche nella famiglia di discendenza ebraica Ahkenazy riportata da Liede et al., i pazienti erano portatori di una singola mutazione, sebbene tre diversi alleli patogeni (due in BRCA1 e uno in BRCA2) segregassero nella famiglia. Tuttavia, se è vero che finora non sono state riportate mutazioni omozigoti in BRCA1 (presumibilmente non compatibili con la vita), mutazioni omozigoti o eterozigoti composte in BRCA2 possono causare l’anemia di Fanconi. È interessante notare che è stato desctitto in letteratura il caso di un ragazzo di 13 anni affetto da medulloblastoma con una mutazione missenso in omozigosi nel gene BRCA2. Il padre di questo paziente era eterozigote per la mutazione (Bayrakli et al., 2011, PMID 22044372).
Riassumendo, bisogna tenere in considerazione i seguenti casi riguardo a mutazioni multiple nei geni BRCA1 e BRCA2:
- Segregazione di una mutazione in BRCA1 e una in BRCA2 in una famiglia: i membri della famiglia possono portare una delle due o entrambe le mutazioni (doppia eterozigosi). Anche se sono stati segnalati casi di esordio precoce, è ancora controverso se la doppia eterozigosi possa influenzare la gravità del fenotipo.
- Segregazione di due mutazioni BRCA1 in una famiglia: i pazienti possono avere solo una delle due mutazioni, poiché si ritiene che l’eterozigosi composta o l’omozigosi per due mutazioni BRCA1 non sia compatibile con la vita.
- Mutazioni omozigoti in BRCA2: le mutazioni omozigoti o eterozigoti composte in BRCA2 causano l’anemia di Fanconi. È stato riportato un adolescente con medulloblastoma e una mutazione missenso in BRCA1 in omozigosi.
- Segregazione di tre mutazioni dei geni BRCA: è stata descritta una famiglia con due mutazioni in BRCA1 e una in BRCA2. Le mutazioni segregano indipendentemente in diversi membri della famiglia.
Vedi i nostri pannelli relativi al cancro della mammella e dell’ovaio:
