MLPA: 10 DOMANDE E RISPOSTE
MLPA è acronimo di Multiplex Ligation Probe Amplification. Si tratta di una metodica di genetica molecolare basata sulla PCR che si utilizza per identificare grandi delezioni o duplicazioni/moltiplicazioni non rilevabili dal sequenziamento. L’alternativa alla MLPA è la qPCR (quantitative PCR).
1. La MLPA va fatta sempre?
No, la Multiplex Ligation Probe Amplification non è sempre indicata e la sua esecuzione è inutile in molti casi. Generalmente si procede allo studio delezioni/duplicazioni solo quando, per il gene in questione, tali mutazioni siano già state descritte in letteratura. Vi sono infatti geni nei quali queste mutazioni sono poco o per nulla probabili (ad esempio alcuni geni associati a patologie a trasmissione autosomica dominante dovute a mutazioni puntiformi gain-of-function).
2. In che fase dell’iter diagnostico è opportuno eseguire la MLPA?
Sovente, e intelligentemente, la MLPA viene eseguita solo in seconda battuta, cioè in caso di esito negativo al sequenziamento. Di regola, infatti, nella patologia genica, sono le piccole mutazioni puntiformi o le delezioni/inserzioni di poche basi ad essere le più frequenti, mentre le delezioni e le duplicazioni di grandi dimensioni sono più rare. Esistono tuttavia alcune eccezioni dovute a geni nei quali si hanno prevalentemente o quasi esclusivamente grandi delezioni o grandi duplicazioni (si veda ad esempio il gene SMN1). In tali casi è dunque indicato eseguire prima (o soltanto) la MLPA.
3. Per quali geni va fatta la MLPA?
Non esiste una regola generale per selezionare i geni a priori. In linea di massima giova controllare lo spettro mutazionale nei principali database come Genereviews, HGMD, ClinVar, dbVar, DECHIPHER o Ensembl. Per associazioni gene-malattia recentemente caratterizzate è lecito aspettarsi di tutto, mentre laddove lo spettro mutazionale di una gene sia ben noto e grandi delezioni/duplicazioni non siano mai state riportate (o siano rarissime) l’MLPA può considerarsi superflua o di importanza secondaria.
4. Quando è indicata la MLPA e quando la qPCR?
La risposta è molto semplice: si procede alla qPCR (che è tecnicamente più complessa e più costosa, almeno nella fase di progettazione iniziale) quando non è disponibile il kit commerciale per la MLPA. È importante sottolineare, a tale proposito, che la stragrande maggioranza delle MLPA sono eseguite utilizzando i kit della MRC-Holland: per verificare se il kit per l’analisi di un certo gene sia disponibile o meno è sufficiente eseguire una rapida ricerca sul sito MRC-Holland.
5. È meglio la qPCR o la MLPA?
Come detto sopra, la qPCR è di solito una scelta obbligata laddove il kit commerciale della MLPA non sia disponibile. Entrambe le metodiche, se ben eseguite, danno risultati eccellenti. L’aspetto meno attraente della qPCR è che va disegnata appositamente dal laboratorio e la sua efficacia (e copertura) sono quindi operatore e budget*-dipendenti. La MLPA viene invece fornita come kit commerciale testato e collaudato (resta comunque necessario un minimo di pratica nella preparazione della reazione, che richiede un allestimento particolare in fase di pre-amplificazione, e nella calibrazione del software di analisi).
*La qPCR, soprattutto se eseguita appositamente per un unico campione, può essere molto più costosa della MLPA, specialmente per geni di grosse dimensioni per i quali si renda necessario produrre un elevato numero di ampliconi.
6. La MLPA copre l’intero gene?
Dipende. Ancora una volta è indispensabile fare riferimento alla casa produttrice per verificare quanti e quali esoni del gene sono coperti dal kit. Nella maggior parte dei casi si ha una copertura totale, ma in alcuni geni si possono testare solo alcuni esoni. I fact sheets della ditta contengono questa informazione in modo molto chiaro.
7. La MLPA identifica solo grandi delezioni e duplicazioni?
No. Un’altra utile applicazione della MLPA è la possibilità di poter testare, previo uso di kit appositamente modificati, lo stato di metilazione di un gene. Con i kit MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) è infatti possibile eseguire il test per diverse patologie da imprinting, dalla sindrome di Beckwith-Wiedemann alle sindromi di Angelman e Prader-Willi. L’unica accortezza sta nel tener presente che lo spettro mutazionale delle patologie da imprinting è molto complesso e che la negatività alla MS-MLPA non è sufficiente a escludere la diagnosi.
8. Qual è il livello di sensibilità e specificità della MLPA?
La possibilità di falsi negativi e falsi positivi o di errori esiste in tutte le metodiche, ma la MLPA è generalmente una tecnica affidabile. La casa produttrice MRC-Holland raccomanda di eseguire sempre la conferma di un eventuale risultato positivo tramite una metodica alternativa come, ad
esempio, la qPCR. Questa indicazione rimane tuttavia negletta da tutti i laboratori, principalmente per l’affidabilità intrinseca del metodo MLPA e per ovvie ragioni di costi. La conferma tramite qPCR può essere tuttavia indicata quando la MLPA rilevi una delezione di singolo esone.
9. Perché è indicato confermare la delezione di singolo esone con una metodica alternativa?
Essendo una metodica basata sulla PCR, la MLPA è soggetta ad alcune problematiche tipiche della PCR come la possibilità del non-appaiamento fra primer e DNA e conseguente allele drop-out. Se il paziente è portatore di un polimorfismo proprio all’interno della sequenza complementare a uno dei primer della MLPA, è possibile che l’amplificazione del relativo tratto di DNA non abbia luogo dando così un segnale di delezione e generando di fatto un falso positivo. Dunque, ogniqualvolta la MLPA dia un segnale di delezione di singolo esone (e specialmente nel caso in cui tale risultato risulti strano o poco verosimile rispetto alla specificità clinica del caso) è bene prendere in considerazione la conferma tramite qPCR.
10. MLPA o FISH?
Alcune mutazioni rilevabili dalla FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) sono rilevabili anche dalla MLPA, e viceversa. Si tratta sostanzialmente di una questione di dimensioni. Per delezioni o duplicazioni di dimensioni molto grandi, la MLPA può rilevare la presenza della mutazione tramite segnali anomali provenienti da alcuni geni della regione, mentre la FISH può rilevar l’intera estensione della mutazione.
