Il sequenziamento dell’intero esoma (WES, whole exome sequencing) viene sempre più utilizzato nella pratica clinica, soprattutto pediatrica, per identificare la causa in pazienti per cui vi è un sospetto di malattia genetica o per i grandi studi il cui scopo è identificare nuovi geni malattia.
Grazie all’avanzamento tecnologico, all’abbassamento dei costi e alla riduzione dei tempi necessari alla diagnosi, il sequenziamento massivo ha rivoluzionato l’approccio allo studio delle malattie genetiche.
Ma ad oggi, come viene applicato nella pratica clinica il sequenziamento dell’intero esoma? In quanti casi permette di raggiungere la diagnosi definitiva?
Qual è la mutation detection rate dell’esoma?
Per mutation detection rate si intende la percentuale dei casi nella quale l’applicazione del sequenziamento dell’intero esoma permette di identificare la mutazione causativa di una patologia e di confermare al paziente la diagnosi.
Sebbene il WES sia una delle analisi sempre più utilizzate nell’ambito dei test genetici, ad oggi non sono disponibili dati generali e universalmente accettati sulla percentuale di successo della sua applicazione. Ad esempio, considerando l’applicazione del WES nell’ambito dei disturbi del neurosviluppo si ha una resa diagnostica stimata tra il 30% e il 45%. Mahler e colleghi hanno raggiunto una resa diagnostica del 42% attraverso uno studio interdisciplinare su 50 bambini; Zhai e colleghi hanno trovato la causa della malattia nel 35.13% dei pazienti, in una coorte di 74 probandi con età compresa tra 8 e 29 anni ; Dong et al. hanno raggiunto il successo diagnostico nel 36.4% dei casi, partendo da una coorte di 1090 pazienti con diagnosi di disturbo dello sviluppo.
Per quanto riguarda il campo dell’epilessia, la resa diagnostica media varia tra il 26.7% e il 42%: Sun e colleghi hanno identificato la variante responsabile del fenotipo nel 39.7% dei casi, in una coorte di 73 bambini con diagnosi di encefalopatia epilettica. Tuttavia, possono esserci delle eccezioni: in una coorte di 102 casi pediatrici con diagnosi di epilessia e disabilità intellettiva, Yang e colleghi hanno trovato la causa della malattia attraverso il sequenziamento dell’intero esoma solo in 17 casi (16.7%).
In uno studio condotto su 1360 pazienti pediatrici senza un particolare sospetto clinico da Zhang e colleghi, la resa diagnostica derivante dall’analisi del solo sequenziamento dell’esoma è stata del 37% circa.
A cosa è dovuta questa variabilità?
Uno dei principali fattori che influenzano la mutation detection rate in tutti gli studi è la scelta della coorte di partenza. Numero di pazienti, criteri di inclusione, età, sesso, origine geografica e presentazione fenotipica sono tutti parametri in grado di far variare la resa diagnostica. A cui bisogna aggiungere il tipo di patologia investigata (in alcune malattie, la mutazione non viene trovata nella maggior parte dei pazienti) e la tecnologia impiegata (kit di arricchimento differenti, filtering delle varianti, qualità delle chiamate…).
Un altro aspetto molto importante è l’interpretazione e la classificazione delle varianti: generalmente per il calcolo della resa diagnostica si considerano le varianti patogene o verosimilmente patogene, classificate secondo i criteri ACMG. Tuttavia, l’applicazione criteri interni al singolo laboratorio, l’expertise del data scientist e l’accesso ad un grande numero di informazioni sulla singola variante possono far variare notevolmente l’interpretazione di una variante.
Come è possibile aumentare la resa diagnostica?
- Sequenziamento dei trios vs. singleton
Uno dei modi più semplici per aumentare la resa diagnostica del sequenziamento dell’intero esoma è sequenziare, oltre al probando, anche i suoi genitori, in quello che viene definito trio-WES. Infatti, secondo Zhang e colleghi, il sequenziamento dei trios ha permesso di aumentare la resa diagnostica ottenuta del 6.29% rispetto al sequenziamento dei singleton. Questo è dovuto al fatto che l’analisi trio permette di scartare le varianti non rilevanti grazie all’applicazione dei modelli genetici e di identificare rapidamente le varianti de novo.
- Analisi delle CNV
È diventato sempre più evidente che non solo le single nucleotide variant (SNV) ma anche le copy number variant (CNV) possono avere un ruolo nella patogenesi di una malattia. Non solo, in alcuni tipi di malattie, come i disturbi dello sviluppo psicomotorio, le CNV sono così frequenti che le linee guida indicano il chromosomal micro-array (CMA) come primo step per la diagnosi.
Oltre ai classici metodi molecolari come il CMA o l’MLPA per la ricerca delle CNV, sta prendendo sempre più piede l’analisi algoritmica delle CNV a partire dai dati del sequenziamento WES, che però ha tutt’oggi numerosi limiti.
Ad ogni modo, la ricerca delle CNV ha permesso di aumentare la resa diagnostica dello studio di Zhai e colleghi del 18.92%, nel lavoro di Sun et al. del 6.8%, e nello studio di Zhang et al. del 6.99%.
- Informazioni cliniche dettagliate
Avere informazioni cliniche dettagliate aiuta la fase di interpretazione dei dati ottenuti dal WES e permette al data scientist di distinguere una malattia dall’altra. Integrando i dati genetici alle informazioni cliniche approfondite, è possibile discernere anche tra quelle che hanno dei quadri clinici molto sovrapponibili. Secondo lo studio di Zhang et al., avere un maggior numero di termini HPO per la descrizione del fenotipo del paziente ha permesso di aumentare la resa diagnostica di circa il 10%.
E se tutto questo non fosse sufficiente?
Se nonostante tutti questi accorgimenti, l’analisi del probando non fornisce risultati conclusivi è sempre possibile procedere con il sequenziamento dell’intero genoma. Infatti, nonostante circa l’80-85% delle mutazioni ricadano nella porzione codificante dei geni (quella sequenziata dall’esoma), una porzione minoritaria di mutazioni può ricadere nelle regioni introniche, regolatorie e negli UTR, che vengono sequenziati solo nel sequenziamento dell’intero genoma (WGS, whole genome sequencing).
Ad esempio, secondo lo studio di Ma e colleghi condotto su 52 pazienti con cataratta congenita, il WGS ha permesso di aumentare la resa diagnostica di circa il 10%. I principali vantaggi che derivano dal WGS, oltre al sequenziamento delle regioni escluse dal WES, sono la possibilità di identificare piccole delezioni/duplicazioni che sfuggono all’analisi CMA, la possibilità di sequenziare le regioni ricche in GC e le regioni ripetute con maggior efficacia.
Bibliografia
Yang M, Xu B, Wang J, Zhang Z, Xie H, Wang H, Hu T, Liu S. Genetic diagnoses in pediatric patients with epilepsy and comorbid intellectual disability. Epilepsy Res. 2021 Feb;170:106552. doi: 10.1016/j.eplepsyres.2021.106552. Epub 2021 Jan 7. PMID: 33486335.
Mahler EA, Johannsen J, Tsiakas K, Kloth K, Lüttgen S, Mühlhausen C, Alhaddad B, Haack TB, Strom TM, Kortüm F, Meitinger T, Muntau AC, Santer R, Kubisch C, Lessel D, Denecke J, Hempel M. Exome Sequencing in Children. Dtsch Arztebl Int. 2019 Mar 22;116(12):197-204. doi: 10.3238/arztebl.2019.0197. PMID: 31056085
Zhai Y, Zhang Z, Shi P, Martin DM, Kong X. Incorporation of exome-based CNV analysis makes trio-WES a more powerful tool for clinical diagnosis in neurodevelopmental disorders: A retrospective study. Hum Mutat. 2021 May 20. doi: 10.1002/humu.24222. Epub ahead of print. PMID: 34015165.
Dong X, Liu B, Yang L, Wang H, Wu B, Liu R, Chen H, Chen X, Yu S, Chen B, Wang S, Xu X, Zhou W, Lu Y. Clinical exome sequencing as the first-tier test for diagnosing developmental disorders covering both CNV and SNV: a Chinese cohort. J Med Genet. 2020 Aug;57(8):558-566. doi: 10.1136/jmedgenet-2019-106377. Epub 2020 Jan 31. PMID: 32005694
Sun D, Liu Y, Cai W, Ma J, Ni K, Chen M, Wang C, Liu Y, Zhu Y, Liu Z, Zhu F. Detection of Disease-Causing SNVs/Indels and CNVs in Single Test Based on Whole Exome Sequencing: A Retrospective Case Study in Epileptic Encephalopathies. Front Pediatr. 2021 May 13;9:635703. doi: 10.3389/fped.2021.635703. PMID: 34055682
Zhang Q, Qin Z, Yi S, Wei H, Zhou XZ, Su J. Clinical application of whole-exome sequencing: A retrospective, single-center study. Exp Ther Med. 2021 Jul;22(1):753. doi: 10.3892/etm.2021.10185. Epub 2021 May 12. PMID: 34035850
Ma A, Grigg JR, Flaherty M, Smith J, Minoche AE, Cowley MJ, Nash BM, Ho G, Gayagay T, Lai T, Farnsworth E, Hackett EL, Slater K, Wong K, Holman KJ, Jenkins G, Cheng A, Martin F, Brown NJ, Leighton SE, Amor DJ, Goel H, Dinger ME, Bennetts B, Jamieson RV. Genome sequencing in congenital cataracts improves diagnostic yield. Hum Mutat. 2021 Jun 8. doi: 10.1002/humu.24240. Epub ahead of print. PMID: 34101287.
