Quando considerare l'analisi dell'esoma?
Non sempre il problema è la mancanza di test genetici.
Spesso, semplicemente, non vengono eseguiti i test più appropriati per il quadro clinico presente.
Sebbene il → Whole Exome Sequencing rappresenti oggi uno degli strumenti diagnostici più completi disponibili in genetica medica, esistono alcune situazioni in cui il suo impiego risulta particolarmente indicato:
- quando si sospetta una malattia rara o una sindrome genetica, ma non è ancora chiaro quale possa esserne la causa;
- quando sintomi, segni clinici, malformazioni o disfunzioni coinvolgono più organi o apparati;
- quando diversi specialisti hanno formulato ipotesi diagnostiche differenti;
- quando precedenti pannelli genetici non hanno fornito una risposta conclusiva;
- quando il percorso diagnostico prosegue senza una spiegazione unificante.
In queste situazioni, il Whole Exome Sequencing consente di analizzare simultaneamente l’intera regione codificante del genoma umano, ampliando significativamente lo spazio diagnostico disponibile.
È importante non confondere il Whole Exome Sequencing con il cosiddetto Clinical Exome Sequencing, che limita l’analisi ai soli geni attualmente associati a malattia (circa 6.000). Sebbene i due termini vengano talvolta utilizzati come sinonimi, si tratta di approcci differenti con potenzialità diagnostiche diverse. Resta ammissibile parlare di Clinical Whole Exome Sequencing a sottolineare l’applicazione diagnostica dell’analisi che viene comunque eseguita sull’intero esoma.
L'esoma non è sempre uguale
Quando si parla di → Whole Exome Sequencing, si tende spesso a considerarlo come un esame unico. In realtà, esistono diverse modalità di esecuzione che possono influenzare significativamente l’efficacia dell’analisi.
Nella forma più semplice, viene analizzato soltanto il DNA del paziente (Singleton WES o WES solo).
In altri casi, vengono studiati contemporaneamente anche i genitori biologici (Trio WES o WES trio), permettendo di confrontare direttamente le varianti genetiche presenti all’interno della famiglia. Qualche volta, specialomente in ambito ospedaliero, viene richiesta anche l’aggiunta di altri familiari, ad esempio un fratello o una sorella (affetti o non affetti) del caso indice, cioè del primo figlio affetto (WES tetra). In casi ancora più particolari si esegue l’indagine esclusivamente su due fratelli o altri consanguinei (WES duo).
La scelta tra Singleton WES e WES trio dipende da numerosi fattori, tra cui l’età del paziente, il sospetto clinico, la disponibilità dei familiari e gli obiettivi dell’indagine diagnostica.
In particolare, nei bambini con sospetta malattia genetica, l’analisi in trio può aumentare la capacità di identificare varianti causative e facilitare l’interpretazione dei risultati.
Cosa succede dopo l'esoma?
Il Whole Exome Sequencing può rappresentare il punto di arrivo di un percorso diagnostico oppure, in alcuni casi, una delle sue tappe più importanti.
In alcuni casi l’analisi identifica rapidamente una variante causativa e consente di raggiungere una diagnosi molecolare definitiva. Non di rado, specialmente dopo anni di odissea diagnostica, questo può rappresentare non soltanto un traguardo e un sollievo, ma anche la reinterpretazione di un intero periodo di vita.
In altri casi vengono identificate varianti che richiedono ulteriori approfondimenti clinici, familiari o funzionali.
Talvolta, invece, il risultato risulta negativo. Questo non significa necessariamente che la causa genetica sia stata esclusa. Alcune mutazioni possono infatti appartenere a categorie non rilevabili dall’esoma oppure trovarsi al di fuori delle regioni codificanti, richiedendo tecnologie alternative o un’estensione analitica maggiore (ad esempio → Whole Genome Sequencing)
In sintesi, qualunque sia il risultato, il WES (singleton o trio) rappresenta uno step diagnostico fondamentale e una pratica ormai imprescindibile in numerose condizioni genetiche complesse.
→ Se questa situazione ti è familiare, il percorso diagnostico può iniziare da qui.
Per fare lo screening di tutti i 20.000 geni umani
Exome Sequencing è un termine che identifica il sequenziamento delle regioni codificanti (esoni) dei geni di un individuo. È importante sottolineare che esiste una differenza fondamentale fra Whole Exome Sequencing (WES), che comprende tutti i 20.000 geni umani, e Clinical Exome Sequencing (CES), che comprende tutti i geni fino ad ora noti per essere associati a malattia (circa 6.000) e, ancora, una differenza ancora maggiore fra WES, CES e pannelli basasti su queste metodiche di sequenziamento che però includono nell’analisi bioinformatica e clinica solo un numero limitato di geni.
La storia
Fino a pochi anni fa il test genetico classico consisteva nel sequenziamento di singolo gene (o di un ristretto pannello di geni) tramite la metodica dell’elettroforesi capillare (più comunemente nota come sequenziamento Sanger).
L’avvento delle nuove tecnologie di sequenziamento (Next Generation Sequencing) ha invece trasformato lo studio della genetica delle malattie umane portando ad un’epoca che, in termini di volumi nella generazione di dati genomici umani, non ha precedenti.
Grazie all’ottimizzazione della tecnologia NGS, è diventato possibile analizzare un elevatissimo numero di frammenti di DNA fino ad ottenere la sequenza di moltissimi geni in parallelo o, come nel caso dell’esoma, di tutti quanti i 20.000 geni, cioè di tutte le regioni codificanti dell’individuo. Ciò è di estremo interesse sia per la dignostica di routine che per la ricerca scientifica.
Infatti, anche se la regione codificante rappresenta soltanto l’1% di tutto il genoma, si stima che fino all’85% di tutte le mutazioni patogene cadano all’interno di questa regione. La progressiva adozione dell’analisi di genoma intero (→ Whole Genome Sequencing) ha permesso di identificare anche le mutazioni che cadono fuori dalle regioni codificanti, cionondimeno l’analisi WES (solo o trio) continua a mostrare tassi di successo diagnostico sorpredenti e, di sicuro ancora oggi, il miglior rapporto costo/beneficio fra le metodiche high-throughput.
L’introduzione dell’analisi delle Copy Number Variants (CNV) nei moderni workflow di Whole Exome Sequencing ha ulteriormente ampliato le potenzialità diagnostiche dell’esoma. Oggi, nei laboratori di genomica clinica più avanzati, la ricerca delle CNV è generalmente inclusa nell’analisi standard dell’esoma.
Questo ha profondamente modificato l’approccio diagnostico a numerose condizioni genetiche, in particolare nei pazienti con ritardo dello sviluppo, disabilità intellettiva e malformazioni congenite multiple. In passato, infatti, il percorso diagnostico prevedeva spesso come primo livello l’esecuzione di cariotipo e array-CGH, riservando l’esoma a una fase successiva.
Grazie alla possibilità di identificare contemporaneamente varianti di sequenza e numerose alterazioni di numero di copie (CNV), il Whole Exome Sequencing viene oggi sempre più spesso considerato un test di prima linea. In molti casi, le alterazioni genomiche tradizionalmente ricercate mediante array-CGH possono infatti essere rilevate anche attraverso l’analisi delle CNV da esoma, talvolta con una risoluzione superiore nelle regioni adeguatamente coperte dal sequenziamento.
Per questo motivo, le più recenti linee di tendenza in genomica clinica vedono il Whole Exome Sequencing come uno dei principali strumenti diagnostici iniziali nelle patologie genetiche complesse.
La soluzione all’Odissea Diagnostica
L’analisi Whole Exome Sequencing (WES) è stata a lungo considerata un esame di secondo o terzo livello, riservato ai casi clinici nei quali numerosi accertamenti precedenti non erano riusciti a identificare una diagnosi.
Oggi, soprattutto nei sistemi sanitari più avanzati, questo paradigma sta progressivamente cambiando. Grazie all’elevata resa diagnostica e alla possibilità di analizzare simultaneamente l’intera regione codificante del genoma umano, il Whole Exome Sequencing viene sempre più spesso considerato un test di prima linea nelle condizioni genetiche complesse, dalle malattie rare pediatriche alle patologie neurologiche ad esordio nell’età adulta.
Secondo numerosi studi, un paziente affetto da malattia rara può attendere per anni prima di ottenere una diagnosi definitiva. In passato, il tempo medio necessario poteva superare i sette anni; non sono tuttavia rari i casi in cui il percorso diagnostico si è protratto per decenni.
Questa situazione, caratterizzata da visite specialistiche ripetute, esami inconcludenti e frequenti cambi di ipotesi diagnostica, viene comunemente definita odissea diagnostica.
Oggi il Whole Exome Sequencing, sia nella configurazione solo (singleton) sia nella configurazione trio, insieme al Whole Genome Sequencing (WGS), rappresenta uno degli strumenti più efficaci per abbreviare o interrompere questo percorso, consentendo di concentrare in un’unica analisi informazioni che in passato richiedevano anni di accertamenti successivi.
Come già accennato, il termine esoma viene talvolta utilizzato per descrivere analisi molto diverse tra loro. In alcuni casi vengono impropriamente definiti “esomi” anche pannelli limitati a poche centinaia di geni.
La distinzione più importante resta quella tra Clinical Exome Sequencing (CES) e Whole Exome Sequencing (WES).
Il Clinical Exome Sequencing limita l’analisi ai geni attualmente associati a malattia (circa 6.000–7.000 geni), mentre il Whole Exome Sequencing comprende l’intera regione codificante del genoma umano, pari a circa 20.000 geni, spesso integrata da una copertura dedicata del DNA mitocondriale (mtDNA).
Nella moderna diagnostica delle malattie rare, il ruolo del Clinical Exome Sequencing si è progressivamente ridotto a favore del Whole Exome Sequencing, che offre una maggiore completezza analitica, una migliore possibilità di rivalutazione futura dei dati e una maggiore flessibilità interpretativa nel tempo.
Per questo motivo, quando l’obiettivo è identificare la causa genetica di una condizione complessa, il Whole Exome Sequencing rappresenta oggi l’approccio generalmente preferibile.
Portfolio esoma Breda Genetics
Breda Genetics offre uno dei portfolio più articolati di Whole Exome Sequencing ad uso medico. Come specialisti nelle malattie rare e genetisti molecolari con lunga esperienza diagnostica, abbiamo imparato a utilizzare l’analisi dell’esoma nelle sue diverse applicazioni cliniche e di ricerca.
Le nostre soluzioni di Whole Exome Sequencing sono oggi tutte basate sul sequenziamento dell’intera regione codificante del genoma umano, comprendente circa 20.000 geni.
Disponibili sia in regime di diagnostica clinica sia come servizio di sequencing-only per laboratori partner, le nostre piattaforme includono attualmente Twist Exome RefSeq + mtDNA e Agilent SureSelect Human All Exon V8.
La profondità di lettura (coverage depth) è costantemente elevata e supportata da elevati standard qualitativi lungo tutto il processo analitico. La qualità degli allineamenti, l’ottimizzazione dei workflow bioinformatici e l’utilizzo di ampie casistiche di riferimento consentono inoltre un’analisi sempre più accurata delle Copy Number Variants (CNV), oggi parte integrante dell’interpretazione genomica moderna.
Applicazioni dell’analisi dell’esoma
1. Diagnostica della patologia Mendeliana
Le malattie mendeliane rappresentano una delle principali applicazioni del Whole Exome Sequencing. Prima dell’avvento delle moderne tecnologie genomiche, l’identificazione del gene responsabile di una malattia rara richiedeva spesso studi familiari complessi, lunghi processi di mappaggio genomico e anni di lavoro sperimentale.
Oggi il Whole Exome Sequencing consente di analizzare simultaneamente l’intera regione codificante del genoma umano, permettendo l’identificazione diretta di varianti patogene o verosimilmente patogene in migliaia di geni associati a malattia.
Questa rivoluzione tecnologica ha trasformato profondamente la genetica medica. Numerosi geni-malattia sono stati identificati grazie al Whole Exome Sequencing e, ancora oggi, studi basati su Whole Exome Sequencing e Whole Genome Sequencing continuano ad ampliare la nostra conoscenza delle malattie genetiche.
Ogni anno vengono infatti descritte nuove associazioni gene-malattia e nuove manifestazioni cliniche di geni già noti (phenotype expansion), contribuendo a migliorare la diagnosi e la comprensione di numerose patologie rare.
2. Ricerca genomica e malattie complesse
Oltre alla diagnostica delle malattie rare mendeliane, il Whole Exome Sequencing e il Whole Genome Sequencing hanno contribuito in modo significativo alla comprensione delle malattie complesse. L’identificazione di nuove varianti genetiche e di nuovi meccanismi biologici continua ad ampliare la nostra conoscenza di condizioni comuni come le malattie cardiovascolari, neurologiche e immunologiche.