Mutazioni start-loss nelle malattie genetiche rare

Mutazioni puntiformi: un’overview

Le mutazioni sono cambiamenti ereditabili della sequenza del DNA. Le mutazioni possono variare per dimensione e colpire un singolo gene (mutazioni geniche), uno o più cromosomi nella loro struttura (aberrazioni cromosomiche) o uno o più cromosomi nel numero (aneuploidie genomiche). Le mutazioni geniche coinvolgono uno o pochi nucleotidi. Per questo possono comprendere mutazioni puntiformi (chiamate anche SNV, Single Nucleotide Variations), piccole delezioni o inserzioni.

Le mutazioni geniche possono essere distinte sulla base del loro effetto sulla proteina in:

  • Sinonime: quando non comportano il cambio dell’amminoacido codificato, per questo si pensa che non abbiano un impatto sulla struttura finale della proteina;
  • Missenso: quando comportano il cambio dell’amminoacido codificato, e quindi influenzano la struttura proteica finale. Il loro effetto fenotipo può essere benigno, incerto o patogeno.
  • Nonsenso: quando causano uno slittamento del frame di lettura o la formazione di un codone di stop prematuro (proteina tronca). Molto spesso (ma non sempre) queste mutazioni sono patogene.

Ci sono anche altre classi di mutazioni geniche, piuttosto infrequenti, ma possibili:

  • Start-loss: queste mutazioni alterano il codone di inizio, i.e. il primo vero amminoacido della proteina (che è una Metionina), e il loro effetto sulla struttura finale della proteina (e dunque sul fenotipo clinico) è tutt’altro che facilmente deducibile.
  • Stop-loss: anche più rare delle strat-loss, queste mutazioni alterano il codone di stop della proteina. Anche per queste mutazioni, non è facile capire l'effetto finale.

Il sequenziamento dell'intero esoma e dell'intero genoma nelle malattie rare ha aiutato molto l'identificazione e l'interpretazione delle mutazioni start-loss e stop-loss. A causa dello loro frequenza relativamente alta e del loro impatto, in questo post ci concentreremo solo sulle mutazioni start-loss.

La nomenclatura delle mutazioni start-loss: uno sforzo per trovare quella giusta

Anche nella letteratura peer-reviewed, le mutazioni start-loss sono spesso descritte come una semplice variante missenso, e.g.  “p.Met1Val” o “p.Met1Cys”. Tuttavia, questa nomenclatura non è corretta. Perché? Perché la traduzione dell'mRNA in proteina semplicemente non inizia e nessun altro amminoacido viene incorporato al posto della Metionina iniziale.

Dunque, qual è il modo corretto di chiamare le mutazioni che alterano il codone di start? Secondo le linee guida HGVS - Human Genome Variation Society, dobbiamo distinguere due diverse possibilità: (a) l'effetto della proteina è noto e dimostrato con studi funzionali o (b) l'effetto sulla proteina è solo predetto. Quindi:

  1. Se la mutazione causa l’assenza della proteina, la nomenclatura corretta è “p.0” (se dimostrata), o “p.0?” se si tratta di una predizione.
  2. Se l’effetto della mutazione è ignoto, la nomenclatura più corretta è “p.?”
  3. Quando invece gli studi funzionali hanno dimostrato che uno nuovo codone di start si è attivato, bisogna seguire delle regole precise, a seconda che quest’ultimo si trovi a monte o a valle del codone di start canonico.

Le mutazioni start-loss sono sempre patogene?

Impulsivamente verrebbe naturale pensare che le mutazioni che alterano il codone di start siano sempre patogene. In realtà, la valutazione dell'effetto clinico delle mutazioni start-loss è molto complessa e deve tenere conto di alcuni fattori alternativi.

In primis, è stato dimostrato più volte che esistono siti di inizio della traduzione noncanonici o non-AUG che vengono utilizzati dalla cellula per la traduzione delle proteine. Questi siti generalmente non sono efficaci come quelli canonici, ma comunque garantiscono una minima produzione della proteina, che può evitare l’insorgenza del fenotipo patogeno.

In secondo luogo, bisogna considerare l’esistenza per molte proteine di isoforme differenti, alcune delle quali hanno uno codone di inizio diverso. A volte, queste isoforme sono intercambiabili e in grado di sopperire alla mancanza di una delle altre. Infine, una variante che cade sul codone di start di un’isoforma potrebbe anche avere un effetto diverso (e.g. sinonima, missenso, intronica…) sulle altre isoforme. In questi casi, ci sono parametri addizionali da prendere in considerazione: il grado di espressione e la localizzazione tissutale dell’isoforma mutata, che potrebbero decretare o meno la patogenicità di quella variante start-loss.

A complicare ulteriormente l’interpretazione di queste mutazioni, si aggiunge il fatto che queste evidenze sono dimostrabili solamente attraverso studi funzionali in vitro e che difficilmente si può predire a priori quale sarà l’esito di un cambio sul codone di inizio.

Mutazioni start-loss: come dobbiamo interpretarle?

Non esiste una soluzione semplice ed univoca a questa domanda.

Indubbiamente, è necessario cercare di raccogliere tante più informazioni possibili sulla variante per avere un quadro globale della situazione. Dobbiamo sempre tenere a mente:

(1) le linee guida ACMG sull’interpretazione delle varianti loss-of-function;

(2) la frequenza della mutazione

(3) il meccanismo di ereditarietà

(4) se noto, il meccanismo di patogenicità legato al gene di interesse (aploinsufficienza, dominanza negativa, guadagno di funzione)

(5) la sovrapponibilità fenotipica tra il fenotipo associato al gene e i tratti del paziente.

Se possibile, è consigliabile svolgere studi funzionali per verificare l'effetto reale della mutazione start-loss sull'mRNA (anche se sappiamo che, specialmente nella routine diagnostica, questo non è facile da fare).

Attenzione al fenotipo!!

Sebbene spesso le mutazioni start-loss siano associate ad un fenotipo grave, proprio grazie al fatto che la cellula può far affidamento su numerosi “escamotage” per superare la loro presenza, è possibile che il fenotipo risultante da una mutazione di questo tipo si discosti da quello classico associato ad un determinato gene.

Per esempio, Kuper e colleghi hanno riportato il caso di alcuni pazienti con una mutazione start-loss in CLN3 il cui fenotipo era meno grave rispetto ai pazienti con altre mutazioni nello stesso gene. Mutazioni in CLN3 causano la ceroidolipofuscinosi neuronale giovanile, caratterizzata da insufficienza visiva progressiva, crisi epilettiche e demenza progressiva. I pazienti riportati da Kuper avevano lo stesso andamento del fenotipo retinico, ma l’insorgenza del fenotipo neurologico era ritardata e con progressione più lenta. Questa differenza potrebbe essere dovuta, secondo gli autori, al fatto che la mutazione start-loss garantisca una produzione residua della proteina, attraverso uno dei meccanismi sopra-citati.

Un altro esempio interessante è quello riportato da Perenthaler et al.. Gli autori hanno descritto pazienti con una mutazione start-loss in omozigosi nel gene UGP2, che causa una grave forma di encefalopatia epilettica. La peculiarità di questi pazienti sta nel fatto che mutazioni omozigoti loss-of-function in UGP2 sono incompatibili con la vita. Tuttavia, UGP2 ha due isoforme: una più lunga e una più corta (espressa prevalentemente nel cervello). La mutazione identificata in questo studio causa la perdita del codone di inizio solo sull’isoforma più corta, mentre in quella più lunga è una missenso, tollerata dalla cellula. Questo esempio mostra come mutazioni start-loss che colpiscono isoforme tessuto-specifiche possono causare un fenotipo intermedio.

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Citazioni

Na CH, Barbhuiya MA, Kim MS, Verbruggen S, Eacker SM, Pletnikova O, Troncoso JC, Halushka MK, Menschaert G, Overall CM, Pandey A. Discovery of noncanonical translation initiation sites through mass spectrometric analysis of protein N terms. Genome Res. 2018 Jan; 28 (1): 25-36. Doi: 10.1101 / gr. 226050.117. Epub 2017 Nov 21. PMID: 29162641; PMCID: PMC5749180

HGVS- Human Genome Variation Society

Abou Tayoun AN, Pesaran T, DiStefano MT, Oza A, Rehm HL, Biesecker LG, Harrison SM; ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI). Recommendations for interpreting the loss of function PVS1 ACMG/AMP variant criterion. Hum Mutat. 2018 Nov;39(11):1517-1524. doi: 10.1002/humu.23626. Epub 2018 Sep 7. PMID: 30192042; PMCID: PMC6185798.

Kuper WFE, van Alfen C, van Eck L, de Man SA, Willemsen MH, van Gassen KLI, Losekoot M, van Hasselt PM. The c.1A > C start codon mutation in CLN3 is associated with a protracted disease course. JIMD Rep. 2020 Feb 7;52(1):23-27. doi: 10.1002/jmd2.12097. PMID: 32154056; PMCID: PMC7052694.

Perenthaler E, et al. Loss of UGP2 in brain leads to a severe epileptic encephalopathy, emphasizing that bi-allelic isoform-specific start-loss mutations of essential genes can cause genetic diseases. Acta Neuropathol. 2020 Mar;139(3):415-442. doi: 10.1007/s00401-019-02109-6. Epub 2019 Dec 9. PMID: 31820119; PMCID: PMC7035241.

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