Test Genetico Tumori
Metodi attuali per l’analisi molecolare BRCA1 / BRCA2
Il test di BRCA viene comunemente eseguito mediante sequenziamento diretto di Sanger. Questo metodo è considerato il “gold standard” del sequenziamento del DNA. È tecnologicamente affidabile, ampiamente disponibile e ha un flusso di lavoro relativamente semplice.
Gli svantaggi del sequenziamento di Sanger sono:
• produttività limitata
• minor costo-efficacia rispetto al sequenziamento di nuova generazione (NGS)
• incapacità di rilevare grandi riarrangiamenti genomici (LGR; ad esempio: grandi delezioni/duplicazioni).
Poiché sono state riportate ampie delezioni/duplicazioni nei geni BRCA1 e BRCA2, è necessario utilizzare metodi alternativi per rilevarle. Il metodo più comunemente utilizzato per analizzare gli LGR è multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Questa tecnologia si basa su un mix di sonde sintetiche. Ciascuna di esse è composta da due oligonucleotidi che sono in grado di legarsi a regioni di DNA nell’area genomica di interesse e di amplificarsi in modo semiquantitativo solo se entrambi gli oligonucleotidi sono legati e ligati. Esempi di sonde MLPA per i test di BRCA disponibili in commercio e solo per uso di ricerca sono P002/P087 per BRCA1 e P077/P045/P090 per BRCA2 (MRC-Holland, Amsterdam, Paesi Bassi). MRC-Holland suggerisce di confermare le delezioni o le duplicazioni rilevate da un singolo kit utilizzando gli altri kit correlati al gene.
In caso contrario, è possibile procedere al test di delezione/duplicazione BRCA1/2 mediante PCR quantitativa (qPCR). Tuttavia, sebbene la qPCR sia un metodo affidabile, un’analisi completa dei geni BRCA1 e BRCA2 richiede un lavoro intenso per il laboratorio, data la grande quantità di esoni presenti nei geni BRCA1 e BRCA2.
La rapida evoluzione della tecnologia di sequenziamento massivo parallelo sta rivoluzionando la gestione delle malattie ereditarie. Numerosi studi clinici iniziali sui test BRCA hanno già dimostrato che la tecnologia NGS offre elevata sensibilità, specificità, rapida analisi mutazionale di più geni e miglior rapporto costo-efficacia rispetto agli approcci attuali, sebbene la necessità di un’attenta analisi della sequenza per evitare risultati falsi positivi diventi un problema principale, soprattutto in caso di piccole inserzioni/delezioni, varianti rilevate in regioni rupetute ecc. e parametri aggiuntivi come la copertura, il numero e la qualità delle reads diventano cruciali.
Recentemente, le piattaforme da banco NGS hanno reso disponibile il sequenziamento del DNA su scala-gigabasica con tempi di analisi relativamente brevi (24 h), ad esempio MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) o Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Il potenziale della produttività analitica ad alto volume rende le piattaforme NGS un investimento sempre più interessante per i laboratori diagnostici in ambito clinico.
Il test di BRCA con tecnologia NGS offre molti vantaggi rispetto al sequenziamento Sanger, inclusa la possibilità di rilevare LGR in un unico flusso di lavoro, sebbene il rilevamento di LGR in NGS non sia stato completamente stabilito nell’impostazione diagnostica.
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