Quando l’esoma intero (whole exome sequencing -WES) non riesce a dare una risposta
Dal ritardo dello sviluppo o dal ritardo mentale (con o senza tratti autistici) ai disturbi neuromuscolari, sospette condizioni metaboliche, epilessia isolata o sindromica e fenotipi multisistemici complessi, molti pazienti rimangono senza una diagnosi molecolare anche dopo il sequenziamento dell’intero esoma (WES) o persino il WES in trio.
Nonostante l’elevato potenziale diagnostico del WES — e la sua capacità di rilevare non solo varianti a singolo nucleotide e piccole inserzioni o delezioni, ma sempre più spesso anche varianti del numero di copie (CNV) — una percentuale sostanziale di pazienti rimane senza una diagnosi molecolare. La resa diagnostica varia considerevolmente in base al fenotipo, alla selezione dei pazienti, alla struttura familiare, alla qualità del sequenziamento e alla strategia analitica, e può essere sostanzialmente più alta in coorti selezionate.
Quando il WES non è diagnostico, una delle prime domande è se la variante causale possa trovarsi al di fuori delle regioni genomiche effettivamente analizzate dal test. Più specificamente: il paziente potrebbe essere portatore di una variante intronica profonda che non è stata adeguatamente catturata o valutata dall’analisi whole exome sequencing?
La possibile spiegazione, tuttavia, va oltre le sole varianti introniche profonde. Un recente studio di WGS di seconda linea in pazienti con distonia inspiegabile ha identificato varianti elusive che coinvolgono esoni scarsamente coperti dal WES, geni a RNA, DNA mitocondriale, piccole varianti del numero di copie, riarrangiamenti genomici complessi e brevi ripetizioni in tandem. Analisi complementari trascrittomiche e proteomiche hanno anche rivelato un’alterazione patogenetica del trascritto causata da varianti introniche profonde.
Qui ci concentriamo su questa specifica possibilità: la possibilità di una variante intronica profonda patogenica. Cosa può aggiungere il sequenziamento dell’intero genoma (whole genome sequencing) e perché l’identificazione della variante potrebbe essere solo il primo passo verso la dimostrazione della sua patogenicità?
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Cosa sono le varianti introniche profonde?
La maggior parte delle varianti identificate dal sequenziamento dell’intero genoma (WGS) si trova al di fuori degli esoni codificanti proteine. Le varianti introniche si verificano all’interno degli introni, ovvero le sequenze interposte di un gene (le regioni situate tra un esone e l’altro).
Le varianti introniche profonde sono generalmente definite come cambiamenti intronici situati a più di 100 nucleotidi di distanza dal confine esone-introne più vicino. Questa soglia è convenzionale piuttosto che assoluta, ma le distingue dalle regioni immediatamente adiacenti agli esoni che sono più spesso incluse nella progettazione e nell’analisi anche del whole exome sequencing.
A differenza delle varianti intergeniche, le varianti introniche profonde si trovano all’interno di un gene e possono quindi interferire con la sua normale funzione. La maggior parte è considerata benigna. Tuttavia, un sottogruppo piccolo ma clinicamente importante può alterare l’elaborazione dell’RNA e causare malattie monogeniche. La loro probabilità di essere patogenetiche dipende dalla loro rarità nei database di popolazione, dal loro effetto previsto sullo splicing o sulla regolazione genica, dal fenotipo clinico, dai dati di segregazione quando disponibili e dalle prove funzionali di supporto.
In che modo le varianti introniche profonde possono causare malattie?
La maggior parte delle varianti introniche profonde patogenetiche influisce sullo splicing dell’RNA: il processo attraverso il quale gli introni vengono rimossi e gli esoni vengono uniti per produrre l’RNA messaggero finale. Un cambiamento intronico profondo può creare o attivare un sito di splicing criptico, o interrompere le sequenze regolatorie che normalmente influenzano il processo di splicing. Il trascritto risultante può contenere sequenze extra, perdere parte di un esone o utilizzare un confine esonico anomalo.
Le principali conseguenze includono:
- Inclusione di pseudoesoni
Un segmento di DNA intronico viene erroneamente riconosciuto come un esone e inserito nell’RNA maturo. Ciò può interrompere il quadro di lettura o introdurre un codone di stop prematuro. - Ritenzione parziale dell’introne
Parte di un introne viene trattenuta nel trascritto maturo, alterando potenzialmente la proteina codificata o destabilizzando l’RNA. - Salto dell’esone (exon skipping) o confini esonici alterati
Una variante può interferire con i segnali di splicing o i motivi regolatori, facendo cosìche un esone venga tralasciato durante la trascrizione o provocandone l’accorciamento o l’allungamento a causa della creazione di un sito di splicing anomalo. - Alterato equilibrio dei trascritti alternativi
In alcuni geni, una variante intronica profonda può modificare la proporzione relativa delle varie isoforme di RNA presenti in natura per un determinato gene, causando effetti di entità diversa nel tessuto in cui il gene viene espresso.
Questi meccanismi spiegano perché la rilevanza clinica di una variante intronica profonda non può essere dedotta solo dalla sua posizione genomica — e anche perché tale variante non necessariamente debba essere causa di malattia pur impattando lo splicing. L’effetto della variante sul messaggero finale deve essere considerato insieme al fenotipo, al modello di ereditarietà e, quando possibile, alle prove sperimentali derivanti da studi sull’RNA.
Il sequenziamento dell’intero esoma può rilevare varianti introniche profonde?
Il sequenziamento clinico dell’intero esoma (Whole Exome Sequencing – WES), inclusa la WES in trio, rimane un test genomico di prima linea per molti sospetti disturbi monogenici sia nei bambini che negli adulti. Fornisce un’ampia analisi dei geni codificanti proteine mantenendo un costo più accessibile e un ambito analitico più mirato rispetto al sequenziamento dell’intero genoma.
Per progettazione, il WES analizza principalmente gli esoni codificanti proteine e una porzione limitata della sequenza intronica adiacente ai confini esone-introne. L’estensione di questa copertura intronica adiacente varia tra i kit di cattura, le piattaforme di sequenziamento e le pipeline analitiche. Alcune basi introniche più profonde possono essere occasionalmente sequenziate, ma questa copertura non è né completa né uniforme e tali regioni non vengono valutate di routine come parte di un’analisi diagnostica basata su Whole Exome Sequencing.
Le varianti introniche profonde sono generalmente definite come variazioni nucleotidichei situate a più di 100 posizioni dal confine esone-introne più vicino: regioni che cadono al di fuori del target previsto del sequenziamento dell’intero esoma. La risposta pratica è quindi chiara: il WES non è progettato per rilevare o escludere in modo affidabile le varianti introniche profonde. Un risultato WES negativo quindi non esclude la possibilità di una variante patogenetica situata all’interno di queste regioni.
Quattro possibili conseguenze di uno splicing alterato
Inclusione di pseudoesoni
Una sequenza intronica viene inclusa erroneamente come esone aggiuntivo.
Ritenzione parziale dell'introne
Parte di un introne rimane all'interno dell'RNA messaggero maturo.
Salto dell'esone
Un esone viene omesso o viene utilizzato un confine esonico anomalo.
Trascritti alternativi alterati
L'equilibrio tra le isoforme di RNA presenti in natura viene spostato.
Quando si dovrebbe sospettare una variante intronica profonda?
Una variante intronica profonda andrebbe sospetta nelle situazioni cliniche selezionate in cui tali tipi di mutazioni sono o diventano più plausibili:
- Un risultato negativo all’analisi WES o WES trio, in particolare quando il fenotipo rimane fortemente suggestivo di un disturbo monogenico.
- Identificazione di una singola variante patogenetica o probabilmente patogenetica in un gene recessivo corrispondente al fenotipo, quando una seconda variante non è stata trovata attraverso l’analisi convenzionale della regione codificante.
- Patologie in cui le varianti introniche profonde patogenetiche sono già riconosciute come parte rilevante dello spettro mutazionale. Esempi tipici includono la distrofia muscolare di Duchenne, le patologie retiniche ereditarie e condizioni metaboliche selezionate.
Depending on the phenotype, the previous diagnostic pathway, parental availability and budget, whole genome sequencing may be performed as a solo test or in trio. WGS expands the analysis beyond protein-coding exons to include intronic and intergenic regions, as well as mitochondrial DNA and other classes of variation that may be incompletely assessed by WES.
Most pathogenic variants causing monogenic disease are located within coding exons or canonical splice regions. However, a clinically meaningful minority lies elsewhere in the genome. When the clinical context makes this possibility credible, WGS can make deep intronic variants searchable and allow them to be prioritised alongside other non-coding, structural or difficult-to-detect findings.
A practical illustration is provided in our capsule from practice, “When even the exome is just the beginning”, where a negative exome did not represent the end of the diagnostic pathway, and WGS ultimately enabled a diagnosis.
Il Whole genome sequencing non è una soluzione universale e l’interpretazione delle varianti introniche profonde e di altre varianti non codificanti rimane complessa. Tuttavia, il WGS rappresenta oggi l’analisi genomica più completa disponibile nella diagnostica di routine. Quando il budget e il contesto clinico lo consentono, il WGS — e soprattutto il WGS in trio — offre il punto di partenza più ampio e meno limitante per l’indagine di una sospetta malattia monogenica, anche come test di prima scelta.
Per ulteriori considerazioni sulla scelta tra WES in trio e WGS singolo, leggi la nostra Diagnostic Approach dedicata.
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